1、第十三章第十三章基因工程和分子生物學常用技術基因工程和分子生物學常用技術Genetic Engineering and The Popular Technology In Molecular Biology19:46第第1節節 基因工程與基因重組基因工程與基因重組19:46 一、基因工程的概念一、基因工程的概念 基因工程是將各種來源（內、外）的原核、真核、基因工程是將各種來源（內、外）的原核、真核、天然或人工方法獲得目的基因，在體外與載體基天然或人工方法獲得目的基因，在體外與載體基因重組后，導入適當的宿主細胞，因重組后，導入適當的宿主細胞，DNA重組體隨重組體隨著細胞增殖而擴增，再通過基因表達

2、得到大量目著細胞增殖而擴增，再通過基因表達得到大量目的基因片段（分子克隆，的基因片段（分子克隆，clone）的技術。）的技術。 基因工程技術是把不同來源的目的基因和載體基因工程技術是把不同來源的目的基因和載體DNA分子重新組合，故亦稱為重組分子重新組合，故亦稱為重組DNA技術。技術。19:46基因工程四要素基因工程四要素19:46重要的工具酶重要的工具酶發現：發現： 1968年，沃納阿爾伯博士在研究噬菌體的遺傳現象時碰到一個奇怪的現象，當新的大腸菌感染了噬菌體時，有的噬菌體開始繁殖，有的卻根本不繁殖。他決定先研究這種“限制性噬菌體感染現象”，第一次從大腸桿菌中提取出了限制性內切酶，為此獲197

3、8年諾貝爾生理學醫學獎。限制酶能在DNA上尋找特定的切點，將DNA分子的雙鏈交錯地切斷。因此限制性內切酶又稱為“分子剪刀”，可以完整地切下個別基因。目前人們已經分離提取了 400多種“分子剪刀”，可以隨心所欲地進行DNA分子長鏈的切割。 沃納阿爾伯博士19:461.限制性核酸內切酶概念、特點限制性核酸內切酶概念、特點5GAATTC33CTTAAG519:462.限制性核酸內切酶識別序列與切割產物限制性核酸內切酶識別序列與切割產物5GAATTC3 5G AATTC33CTTAAG5 3CTTAA G55CTGCAG3 5CTGGA G33GACGTC5 3G ACGTC55A GCT3 5AG

4、CT33TCG A5 3TC GA5注：具有黏性末端的注：具有黏性末端的DNA分子更容易結合進載體分子更容易結合進載體DNA分子中。分子中。19:46（2）DNA聚合酶（聚合酶（DNA polymerase）19:461976年，科學家在年，科學家在5個實驗室里幾個實驗室里幾乎同時發現并提取出一種酶，這種酶乎同時發現并提取出一種酶，這種酶可以將兩個可以將兩個DNA片段連接來，修復好片段連接來，修復好DNA鏈的斷裂口。這種酶叫作鏈的斷裂口。這種酶叫作DNA連接酶，是連接酶，是名符其實的名符其實的“縫合縫合”基因基因的的“分子針線分子針線”。只要在用同一種。只要在用同一種“分子剪刀分子剪刀”剪切的

5、兩種剪切的兩種 DNA碎片碎片中加上中加上“分子針線分子針線”，就會把兩種，就會把兩種DNA片片段重新連接起來。段重新連接起來。慢病毒環繞雙鏈慢病毒環繞雙鏈DNA的的DNA連接酶（彩色部分）連接酶（彩色部分）19:46載體載體 能夠攜帶外源能夠攜帶外源DNA片段進入受體細胞進行擴片段進入受體細胞進行擴增和表達的運載工具。其化學本質是增和表達的運載工具。其化學本質是DNA。 易進入宿主細胞，并能在體內繁殖。易進入宿主細胞，并能在體內繁殖。 具有多克隆位點，易插入外源基因。具有多克隆位點，易插入外源基因。 有可供選擇的遺傳標記，能夠進行篩選。有可供選擇的遺傳標記，能夠進行篩選。 易從宿主細胞中分離

6、純化。易從宿主細胞中分離純化。 常用載體：質粒、噬菌體、黏粒、病毒。常用載體：質粒、噬菌體、黏粒、病毒。理想載體的選擇標準理想載體的選擇標準19:46 外源外源DNA片斷越長，越片斷越長，越難插入和穩定。難插入和穩定。19:462.噬菌體噬菌體(19:46噬菌體兩種生長途徑（示意圖）噬菌體兩種生長途徑（示意圖）19:463.黏粒黏粒19:464.4.病毒病毒19:46重組重組DNA技術的原理和工程技術的原理和工程19:46 1.目的基因的制備目的基因的制備1 1）制備）制備基因組基因組DNA文文庫庫 使用相同載體的一組使用相同載體的一組基因的克隆。所有被克隆基因的克隆。所有被克隆的的DNA分子

7、能表示整個生分子能表示整個生物的基因組物的基因組。 有質粒文庫、黏粒文庫、有質粒文庫、黏粒文庫、噬菌體文庫、酵母人造染噬菌體文庫、酵母人造染色體文庫。色體文庫。19:462）制備）制備cDNA文庫文庫19:46（3 3）聚合酶鏈反應）聚合酶鏈反應( PCR)( PCR) 在模板在模板DNA、引物、引物、dNTP、TaqDNA聚合酶等聚合酶等條件下，體外經條件下，體外經94變性、變性、54退火及退火及72延延伸伸3個步驟的反復多次循環（個步驟的反復多次循環（25 30次次），擴增），擴增目的基因。目的基因。（4）化學合成基因）化學合成基因19:46 2、 目的基因與載體的連接目的基因與載體的連接

8、 基因工程的核心基因工程的核心 （主要有以下（主要有以下4種連接方式）種連接方式） 1) 粘性末端連接粘性末端連接 2）平頭末端連接平頭末端連接 3）人工接頭法人工接頭法 4）同源多聚尾連接法同源多聚尾連接法19:463 3、重組重組DNADNA導入宿主細胞導入宿主細胞 轉化轉化：以質粒作載體構建的重組體導入受體細胞的過程；以質粒作載體構建的重組體導入受體細胞的過程； 感染感染：以病毒作載體構建的重組體導入受體細胞的過程以病毒作載體構建的重組體導入受體細胞的過程4. .重組重組DNADNA的篩選與鑒定：的篩選與鑒定： 遺傳學、免疫學、分子雜交等遺傳學、免疫學、分子雜交等5.5.克隆基因的表達克

9、隆基因的表達19:46基因工程的主要步驟基因工程的主要步驟19:4619:46二、基因診斷和基因治療二、基因診斷和基因治療（一）基因診斷（一）基因診斷（DNA diagnosis） 19:46 1. 1.基因診斷特點：基因診斷特點：特異性強特異性強靈敏度高靈敏度高（選用特定基因序列作為探針，單拷貝基因采用選用特定基因序列作為探針，單拷貝基因采用高度擴增高度擴增PCR技術）技術）診斷范圍廣診斷范圍廣（可檢測正在生長的病原體或潛在病原體）。可檢測正在生長的病原體或潛在病原體）。能對疾病早期進行診斷能對疾病早期進行診斷 直接對表型疾病作出診斷，還可能發現潛在的致病因素，直接對表型疾病作出診斷，還可能

10、發現潛在的致病因素，如如: 確定有遺傳病家族史的人攜帶致病基因。確定有遺傳病家族史的人攜帶致病基因。19:462.基因診斷的應用基因診斷的應用病原體：病毒、支原體、細菌、寄生病原體：病毒、支原體、細菌、寄生蟲。當無抗體時，基因診斷成為唯一手段。蟲。當無抗體時，基因診斷成為唯一手段。遺傳性疾病。發病原因為特定基因突變。遺傳性疾病。發病原因為特定基因突變。個別細胞基因突變而引起的細胞無限增殖個別細胞基因突變而引起的細胞無限增殖.（包括抑癌基因和癌基因）（包括抑癌基因和癌基因）19:463.基因診斷的基本原理與方法基因診斷的基本原理與方法 基因診斷的原理：用已知的核苷酸序列測定未知基因診斷的原理：用

11、已知的核苷酸序列測定未知的核苷酸序列。的核苷酸序列。 基因診斷主要方法：核酸分子雜交、基因診斷主要方法：核酸分子雜交、PCR技術、技術、DNA序列測定、幾種技術手段聯合應用等序列測定、幾種技術手段聯合應用等 19:46 -地中海型貧血癥（病例）地中海型貧血癥（病例） 一對夫妻第一胎生一男孩，經診斷為重型一對夫妻第一胎生一男孩，經診斷為重型-地中海地中海型貧血癥，即型貧血癥，即Hb Harts 胎兒水腫綜合癥。為常染色體胎兒水腫綜合癥。為常染色體隱性遺傳病。妻子又懷孕，夫妻想知道胎兒是否正常發隱性遺傳病。妻子又懷孕，夫妻想知道胎兒是否正常發育，欲做產前診斷。專家運用限制性內切酶育，欲做產前診斷。

12、專家運用限制性內切酶BamHI和和 Bgl分別酶切孕婦的外周血和胎兒絨毛組織分別酶切孕婦的外周血和胎兒絨毛組織DNA，經，經瓊脂糖凝膠電泳分離后，進行瓊脂糖凝膠電泳分離后，進行Southern印跡轉移后，再印跡轉移后，再用用32P標記的標記的-珠蛋白基因探針進行雜交。分析所得酶珠蛋白基因探針進行雜交。分析所得酶譜，檢測結果該胎兒為譜，檢測結果該胎兒為-地中海貧血。地中海貧血。19:4619:46（二）基因治療（二）基因治療（gene therapuy) 狹義的基因治療狹義的基因治療是指用完整的基因進行基因替代治療，是是指用完整的基因進行基因替代治療，是對缺陷的基因進行修復、矯正，或以正常功能的

13、基因置換對缺陷的基因進行修復、矯正，或以正常功能的基因置換或增補缺陷基因的方法。治療途徑屬于體外（或增補缺陷基因的方法。治療途徑屬于體外（ex vivoex vivo）基因治療。基因治療。 廣義的基因治療廣義的基因治療是指利用基因藥物的治療，是一種基于導是指利用基因藥物的治療，是一種基于導入遺傳物質以改變患者細胞的基因表達，從而達到治療或預防入遺傳物質以改變患者細胞的基因表達，從而達到治療或預防疾病的新措施。治病途徑屬于體內（疾病的新措施。治病途徑屬于體內（in vivoin vivo）基因治療。）基因治療。19:46 基因治療總策略基因治療總策略 1.直接補替缺陷基因；直接補替缺陷基因； 2

14、.抑制非正常基因產物表達；抑制非正常基因產物表達； 3.間接調節機體本身免疫系統的抗病能力；間接調節機體本身免疫系統的抗病能力； 4.利用外源基因對病變細胞造成特異性殺傷。利用外源基因對病變細胞造成特異性殺傷。19:46 基因治療方法：基因治療方法：基因矯正（基因矯正（gene correction）：即對缺陷基因的異常序列進行精確原位修復。基因置換基因置換（gene replacement） ：以正常功能基因原位置換異常基因，不涉及基因組的任何改變。基因增補基因增補（gene augmentation）：不去除異常基因，而是通過外源基因的導入，使其表達正常產物，從而補償缺陷基因的功能。基因失

15、活基因失活（gene inactivation）：有些基因異常過度表達，如癌基因或病毒基因可導致疾病，可用反義核酸技術、核酶或誘餌轉錄因子來封閉或消除這些有害基因的活性表達。19:46基因療法最重要的問題：理想載體的選擇基因療法最重要的問題：理想載體的選擇 安全無毒害；不引起免疫反應；高濃度或高安全無毒害；不引起免疫反應；高濃度或高滴度；能高效轉移外源基因；持續有效表達外源滴度；能高效轉移外源基因；持續有效表達外源基因；可靶向特定組織細胞；可調控；容納外源基因；可靶向特定組織細胞；可調控；容納外源基因可大可小；可供體內注射（包括全身性靜脈基因可大可小；可供體內注射（包括全身性靜脈注射）；便于規

16、模生產供臨床應用。注射）；便于規模生產供臨床應用。19:46基因工程技術在分子醫學上的應用：基因工程技術在分子醫學上的應用：發現疾病基因。發現疾病基因。確定克隆基因在分子遺傳病中的作用。發展生物制藥。發展生物制藥。利用重組DNA技術生產有藥用價值的蛋白質、多肽產品。己經或正投入市場的基因工程產品有胰島素、生長素、促紅細胞生成素等。基因診斷。基因診斷。基因治療。基因治療。遺傳病的防治。遺傳病的防治。利用基因工程技術可進行產前診斷、攜帶者測試、癥候前診斷、遺傳病易感性診斷等。19:46第第2節節 分子生物學常用技術分子生物學常用技術 一、核酸分子雜交技術一、核酸分子雜交技術（nucleic aci

17、d hybridization）19:46分子雜交的雙方：分子雜交的雙方：1、特異標記的探針。、特異標記的探針。2、待測的核苷酸序列。、待測的核苷酸序列。19:46理想探針的選擇方案理想探針的選擇方案 必須為單鏈結構；高度特異性，只與靶核苷酸序列雜交；高度靈敏性；標記物與探針結合后，決不能影響其堿基配對，及探針分子的理化性質；一般探針越長，雜交作用越強，專一性越強。但小片段探針雜交速率快。環境污染小，價格低。 探針種類：基因組DNA探針、cDNA探針、RNA探針、及人工合成的寡核苷酸探針等。19:46（二）核酸分子雜交方法（二）核酸分子雜交方法19:461.Souhern 印跡雜交印跡雜交 將

18、電泳分離的待測DNA片段轉印并結合到一定的固相支持物上，再用標記的DNA探針檢測待測DNA的方法。主要檢測經凝膠電泳分離并轉移到膜上的DNA分子。 Southern印跡雜交的基本過程：印跡雜交的基本過程： 待測核酸樣品的制備；待測DNA樣品的電泳分離；凝膠中核酸的變性（堿變性)；Southern印跡19:46Southern 印跡法可用于克印跡法可用于克隆基因的酶切圖譜分析，隆基因的酶切圖譜分析，檢測特異的檢測特異的DNA序列片斷、序列片斷、基因定位、分子量測定等，基因定位、分子量測定等，在分子克隆、遺傳病診斷、在分子克隆、遺傳病診斷、腫瘤研究、器官移植等方腫瘤研究、器官移植等方面發揮作用。面

19、發揮作用。1975年年,Southern印跡雜交印跡雜交（Southern blot）由英國人埃德）由英國人埃德溫溫邁勒邁勒薩瑟（薩瑟（Edwin Mellor Southern）創建。）創建。 Southern印跡雜交顯色圖片 19:462.Northern印跡雜交印跡雜交 原理原理 Northern印記雜交亦稱為印記雜交亦稱為Northern blot，用于鑒，用于鑒別別RNA的雜交。雜交的受體是的雜交。雜交的受體是RNA，探針可用，探針可用DNA或或RNA片段。其基本原理是將待測的片段。其基本原理是將待測的RNA從從瓊脂糖凝膠中轉印到硝酸纖維素膜上，再與標記瓊脂糖凝膠中轉印到硝酸纖維素膜

20、上，再與標記的探針進行固的探針進行固-液相雜交。液相雜交。19:46 3.斑點及狹縫印跡雜交斑點及狹縫印跡雜交 斑點雜交直接將變性的斑點雜交直接將變性的DNA或或RNA樣品點樣于硝酸纖維樣品點樣于硝酸纖維素膜或尼龍膜上使之成為斑點，再與探針進行雜交。斑點素膜或尼龍膜上使之成為斑點，再與探針進行雜交。斑點印跡為圓形，狹縫印跡為線狀。印跡為圓形，狹縫印跡為線狀。 4.原位雜交（原位雜交（in situ hybridization） 核酸保持在細胞或組織切片中，經適當方法處理細胞或組核酸保持在細胞或組織切片中，經適當方法處理細胞或組織后，將標記的核酸探針與細胞或組織中的核酸進行雜交織后，將標記的核酸

21、探針與細胞或組織中的核酸進行雜交的方法。的方法。19:46二、聚合酶鏈反應（二、聚合酶鏈反應（PCR)（一）概念（一）概念 聚合酶鏈反應（聚合酶鏈反應（Polymerase Chain Reaction，PCR），又），又稱無細胞克隆技術稱無細胞克隆技術(free bacteria cloning technique)，是一，是一種對特定的種對特定的DNA片段在體外進行快速擴增的技術。通過片段在體外進行快速擴增的技術。通過PCR技術，可以簡便快速地從微量生物材料中，以體外擴技術，可以簡便快速地從微量生物材料中，以體外擴增的方式獲得大量特定的核酸序列。增的方式獲得大量特定的核酸序列。（二）（二）

22、PCR的工作原理的工作原理 PCR是體外酶促反應，依據是體外酶促反應，依據DNA復制為理論基礎。復制為理論基礎。19:46PCR反應體系：反應體系：1.耐熱耐熱DNA聚合酶聚合酶 （taqDNA聚合酶） 常用從嗜熱水生菌分離出來的taqDNA聚合酶，在95高溫下依然有活性，最適溫度為7080，不會在熱變性中失活，具有53聚合酶活性，53外切酶活性。2.DNA模板模板 微量待擴增的DNA片段，由組織細胞提取、mRNA反轉錄及人工合成。3.寡聚核苷酸引物寡聚核苷酸引物 根據被擴增的DNA兩側序列而人工合成，通常為20個堿基對左右。4.dNTP原料。原料。 即dATP、dGTP 、dCTP、dTTP

23、，PCR操作時，4種dNTP必須以等摩爾配制，以降低出錯機率。5.含含Mg2+的緩沖液的緩沖液 Mg2+是DNA聚合酶活性所必須的激活劑。19:46PCR的基本步驟：的基本步驟：1.高溫變性高溫變性 高溫95，待擴增的靶DNA雙鏈受熱變性成為兩條單鏈DNA模板。變性時間30s。2.低溫退火低溫退火 將反應液溫度迅速降至低溫（3755），兩條人工合成的寡核苷酸引物與單鏈DNA模板鏈互補結合，形成部分雙鏈。退火時間30s。3.適溫延伸適溫延伸 在最適溫度（72）下，TaqDNA聚合酶以引物3-OH末端為合成的起點，催化4種dNTP沿模板53方向合成DNA新鏈。延伸時間約1.5min。所合成的DNA

24、片段又可作為下一輪熱變性的模板。經過2530個循環后，理論上可使基因擴增109倍以上。19:46聚合酶鏈反應的基本步驟聚合酶鏈反應的基本步驟PCR技術具有簡單快捷、高度靈敏性和特異性，在病原體檢測與治療、遺傳及優生優育、腫瘤基因檢測、免疫檢測、司法鑒定等領域有重要應用。19:46三、三、DNA芯片技術芯片技術DNA芯片（芯片（DNA chip）技術隸屬于生物芯片技術。）技術隸屬于生物芯片技術。DNA芯片通過微加工技術，將數以百萬計特定序列的芯片通過微加工技術，將數以百萬計特定序列的DNA片段（基因探針）有規律地排列，固定于片段（基因探針）有規律地排列，固定于2cm2的硅的硅片、玻片等固相支持物上，構成龐大的片、玻片等固相支持物上，構成龐大的DNA探針陣列，再探針陣列，再與標記的樣品雜交，通過對雜交信號的檢測分析，獲得樣與標記的樣品雜交，通過對雜交信號的檢測分析，獲得樣品的遺傳信息。品的遺傳信息。19:46 DNA芯片的突出優勢：芯片的突出優勢： 基因診斷高效快速，若采用控制電場的方式，基因診斷高效快速，若采用控制電場的方式，雜交時間可在雜交時間可在1 min甚至數秒鐘完成。甚至數秒鐘完成。可同時進可同時進行大規模基因檢測。