1、相關幫助 需要相關抗體試劑的可以訪問Fantibody全球抗體搜索引擎 fantibody全球抗體搜索引擎是一個供公共檢索的抗體數據庫，其抗體信息數據來源于全球范圍的研究機構與商業公司。該引擎由商品化抗體數據庫與抗體應用評價數據庫兩部分組成，以幫助研究者更高效的尋找并評估該抗體的性能。全球抗體搜索引擎是繼基因與蛋白數據庫之后更為復雜的應用型檢索平臺 需要相關的實驗室儀器設備、生物試劑、醫療器械、制藥設備、醫藥原料、體外診斷試劑及耗材與技術服務信息的，可以訪問探生網biomean進行咨詢，期待您的加入第1頁/共55頁一、先天性甲低的新生兒篩查方法 1、酶免疫分析法 (enzymelmmunoas

2、say，EIA) 2、放射免疫分析法 (radioimmunoassay，RIA) 3、免疫放射法 (immunoradiometricassay，IRMA)第2頁/共55頁一、先天性甲低的新生兒篩查方法 4、時間分辨熒光免疫分析法 TRFIA me-resolvedfluorescenceimmunoassay 5、熒光酶免疫分析法FEIA fluoreseenceenzymeimmunoassay 6、自動新生兒疾病篩查系統(automatednewbornscreeningsystem)第3頁/共55頁TSH熒光酶免疫分析法第4頁/共55頁1、原 理第5頁/共55頁1原理 熒光酶免疫分析

3、法(FEIA)是一種高度靈敏的檢測方法，用FEIA測定血hTSH基于一步夾心法原理，采用固相、雙位點熒光酶免疫分析法。 干血斑中洗滌出的hTSH，同時與包被在酶標板上抗hTSH的單克隆抗體分子和辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗hTSH亞基的第二抗體結合。第6頁/共55頁被測TSH抗原被測TSH抗原有兩個抗原決定簇 故叫雙位點位點位點第7頁/共55頁TSH單克隆抗體TSH單克隆抗體TSH單克隆抗體包被在反應板上的TSH單克隆抗體故叫固相第8頁/共55頁HPR標記的抗TSH亞基單克隆抗體HRP位點第9頁/共55頁TSH單克隆抗體被測TSH抗原TSH單克隆抗體TSH單克隆抗體被測TSH抗原被測TSH

4、抗原HPR標記的抗TSH亞基單克隆抗體HPR標記的抗TSH亞基單克隆抗體HPR標記的抗TSH亞基單克隆抗體HPR標記的抗TSH亞基單克隆抗體HRP被測TSH抗原被測TSH抗原HRPHRPHRPTSHTSH單克隆抗體的酶標反應孔內。（一步法）單克隆抗體的酶標反應孔內。（一步法）PH：6.5第10頁/共55頁TSH單克隆抗體被測TSH抗原TSH單克隆抗體TSH單克隆抗體被測TSH抗原被測TSH抗原HPR標記的抗TSH亞基單克隆抗體HPR標記的抗TSH亞基單克隆抗體HPR標記的抗TSH亞基單克隆抗體HPR標記的抗TSH亞基單克隆抗體HRP被測TSH抗原被測TSH抗原HRPHRPHRPHPR標記的抗T

5、SH亞基單克隆抗體HPR標記的抗TSH亞基單克隆抗體被測TSH抗原被測TSH抗原HRPHRP第11頁/共55頁TSH單克隆抗體被測TSH抗原TSH單克隆抗體TSH單克隆抗體被測TSH抗原被測TSH抗原HPR標記的抗TSH亞基單克隆抗體HPR標記的抗TSH亞基單克隆抗體HPR標記的抗TSH亞基單克隆抗體HRPHRPHRP第12頁/共55頁TSH單克隆抗體被測TSH抗原TSH單克隆抗體TSH單克隆抗體被測TSH抗原被測TSH抗原HPR標記的抗TSH亞基單克隆抗體HPR標記的抗TSH亞基單克隆抗體HPR標記的抗TSH亞基單克隆抗體HRPHRPHRPPH：7.8第13頁/共55頁2HPPA+H2O2

6、DPDPA+2H2OHRP第14頁/共55頁原理 以甘氨酸緩沖液終止酶反應。PH：10.3第15頁/共55頁原理 用熒光讀數儀以320nm為激發光，405nm為發射光測定熒光值。由于熒光強度與酶標反應板上結合的hTSH數量成正比，因此，通過已知濃度的標準血斑熒光值和樣本的熒光值，也就可換算出樣本血斑中hTSH的含量。第16頁/共55頁特點： 熒光物質為DPDPA，是由HPPA與雙氧水在HRP的作用下脫氫結合而成，它吸收特定波長（320nm）的光能后，發生原子重排，同時發射出更長波長（405nm）的光。 激發光波長320nm發光波長405nm第17頁/共55頁特點： 鑒于HPPA（3-P-羥基苯

7、丙酸）敏感性高、動力學范圍廣，已被廣泛用于替代傳統EIA顯色劑，作為辣根過氧化物酶的底物。以HPPA作底物的FEIA可檢測極低和極高濃度，具有明顯優勢，由于hTSH樣本正常值與非正常值之間差異大，故該法特別適用于hTSH檢測。第18頁/共55頁特點： HPPAH2O2反應生成的熒光強度的影響因素中，最重要的是底物濃度、反應液和終止液的pH值。酶反應最佳pH值為7.8。加入堿性緩沖液終止酶反應，又可顯著增強熒光強度。經測定，使用pH10.3、1.5 molL甘氨酸緩沖液可獲得最大熒光強度。在低濃度hTSH下，該緩沖液可使熒光強度增加5倍，當hTSH濃度高于80mIUL時，增強作用依次減弱。第19

8、頁/共55頁特點： 熒光產物穩定，可放置過夜后測定。無論在室溫(2025)或30孵育用FEIA測定hTSH的敏感性無變化；而在37條件下孵育會增加背景熒光，降低靈敏度。建議底物孵育溫度為2030。第20頁/共55頁特點 FEIA檢測法方法先進，重復性高。 一般情況下，批內分析變異系數和批間分析變異系數均小于10。第21頁/共55頁特點 應用FEIA法進行hTSH檢測時，其他垂體激素和人絨毛膜促性腺激素(HCG)對實驗的干擾極小。第22頁/共55頁2、儀器和試劑第23頁/共55頁以下儀器均由芬蘭Labsystems公司提供第24頁/共55頁(1)、儀器： 、熒光讀數儀；、孵育振蕩儀；、自動洗板儀

9、；、3mm打孔器，或打孔鉗；、加樣器；八道加樣器。以上儀器均由芬蘭Labsystems公司提供。、3mm實驗血片塑料支架；、電腦、打印機；、冰箱。第25頁/共55頁材料 、新生兒篩查濾紙干血斑標本：用S&S903濾紙，按新生兒疾病篩查濾紙干血斑標本采集方法采集；第26頁/共55頁試劑第27頁/共55頁試劑 、抗hTSH包被的酶標板（1）：抗hTSH抗體IgG(小鼠單克隆抗體)包被的酶標板，濃度1.0g/m1。所有包被酶標板均置于有干燥劑的錫箔密封袋中以防止潮濕。潮濕將破壞酶標板的包被，嚴重縮短試劑盒保存期。試劑盒通常儲存在28，為防止打開錫箔密封袋時水蒸氣凝結破壞酶標板性能，試劑盒使用

10、前需置室溫半小時后再打開。若錫箔密封袋在使用前受損或干燥劑變色，請勿使用；第28頁/共55頁 、抗hTSHHRP酶結合物（2） ：辣根過氧化物酶標記的抗hTSH(小鼠單克隆抗體濃度50ngIgGm1)抗體，加02的KathonCGe作為防腐劑；第29頁/共55頁 、酶結合物稀釋液（3） ：緩沖鹽溶液，pH6.5，加0.2的KathonCG作為防腐劑。用于酶結合物的稀釋；試劑第30頁/共55頁 、HPPA熒光底物（4a） ：3P羥基苯丙酸溶于Tris緩沖液(pH7.8)中，加0.2的KathonCGe作為防腐劑；第31頁/共55頁 、H2O2溶液（4b） ：檸檬酸醋酸緩沖液，pH6.0，含過氧化

11、氫。避免與氧化還原劑接觸；第32頁/共55頁 、終止液：甘氨酸緩沖液（5） ，pH10.3；第33頁/共55頁 、洗滌液（6） ：含有吐溫20的磷酸鹽緩沖液，加入0.05Bronidox作為防腐劑。按1:9比例加入蒸餾水稀釋。由于儲于4可能形成結晶，稀釋前溫度需達1830；第34頁/共55頁 、hTSH標準品（7） ：TSH存在于干血濾紙片的血斑中，包括一個零空白。存于裝有干燥劑的鋁箔袋中。加入0.05Bronidox作為防腐劑。標準品由紅細胞壓積為50一55的人血液制得，所含的hTSH濃度經過WHO2nd IRP(80558)校正；第35頁/共55頁 、質控物（8） ：hTSH存在于濾紙上的

12、干血濾紙血斑中。加入005Bronidox作為防腐劑。1張濾紙中具有5套2種濃度質控物(品)，存于裝有干燥劑的鋁箔袋中。 標準品和質控物(品)的TSH濃度有批號差異，需參照每一試劑盒中的標準品和質控物(品)的記錄單。第36頁/共55頁試劑盒內的TSH標準品和質控物的濃度第37頁/共55頁3、實驗操作第38頁/共55頁實驗操作步驟 (1)用編碼機給每一張血片按次序蓋上卡片號，此卡片號也就是我們的檢驗編號。 在檢驗前，所有的試劑和酶標反應板應放置室溫平衡30分鐘。第39頁/共55頁實驗操作步驟 (2)做好實驗登記，包括檢測日期、檢測區間、復查樣本號等。 編寫好實驗操作卡；把本次實驗要做的標準、質控

13、、復查標本、重查標本及常規標本的卡片號在電腦中用不同的顏色的字打印出來，看上去一目了然，嚴防打孔時張冠李戴。第40頁/共55頁試劑批號：163ZC1 標準濃度：1、9、20、44、66、87。質控批號：163ZC1 范 圍：高值：14-37，中值26。低值：0-5，中值3.0。佛山市新生兒疾病篩查中心實驗操作卡 檢測項目: TSH 檢測時間: 2003年11月11日 操作者：第41頁/共55頁實驗操作步驟 （3）對照操作卡在濾紙血斑上打下直徑3mm的標準品(雙孔)、質控物(品)(雙孔)和標本，并依次放置到抗hTSH包被的酶標板孔內。注意：為避免層析效應，應圍繞血樣點中央對稱地打孔。第42頁/共

14、55頁血斑打孔的位置打孔時要選擇合格的血斑，同時要選擇合適的地方，兩面都要看一下。由于層析效應中心位比周邊位的濃度要高10%左右。正確太靠邊太中心第43頁/共55頁實驗操作步驟 (4)加入200l抗hTSHHRP酶結合物。然后用膠膜覆蓋密封。 配制抗hTSHHRP酶結合物溶液：一個酶標反應板需配量，200l酶結合物（2號溶液）加20ml酶結合物稀釋液（3號溶液）。第44頁/共55頁實驗操作步驟 (5)選擇以下步驟進行孵育：過程A：室溫(1830)振蕩孵育3小時，振蕩速率650轉分。過程B：室溫(1830)振蕩15分鐘，4過夜孵育。備注：室溫超過30，最好選擇過程B孵育，以避免高本底干擾。第45

15、頁/共55頁實驗操作步驟 (6)洗板 手工洗滌：去掉溶液和濾紙片， 每孔加入300l的洗滌液，倒去孔內液體并拍打，使孔內無殘液，重復操作4次，倒置于紙巾上； 洗板儀洗滌：洗滌液每孔400l，先洗滌一次，甩掉溶液和濾紙片，再重復洗滌4次。 使用電動打孔去紙片系統可簡化實驗操作。如Labsystems公司的電動打孔器可將樣品固定在一次性塑料支架上，將帶有樣品紙片的支架插入酶標板反應孔內進行反應。孵育結束后，樣品紙片和支架一同去除。第46頁/共55頁實驗操作步驟 (7)每孔加入200l底物溶液。底物溶液的配制：每個3酶標反應板配60ml，即50mlHPPA溶液（4a溶液）加10ml雙氧水溶液（4b溶

16、液）。 (8)室溫1830振蕩孵育l小時。 (9)每孔加入100l終止液，即甘氨酸緩沖液（5號溶液） 。 (10)在60分鐘內，用熒光讀數儀測定各孔的熒光值。第47頁/共55頁實驗操作步驟打孔第48頁/共55頁4、結果計算第49頁/共55頁結果計算 測量結束后，可利用電腦工作軟進行自動處理繪制標準曲線，推薦使用線性坐標，選擇光滑曲線。也可使用手工計算。從標準曲線上讀取質控物和標本的TSH濃度。在試劑盒中均應有質控物(品)和其期望值，只有當質控物(品)測定值在其范圍內，該次實驗才能視為合格。第50頁/共55頁結果計算 發出實驗報告。 做好結果的登記。 保存好結果的原始資料。第51頁/共55頁5注

17、意事項第52頁/共55頁注意事項 (1)所用試劑需正確儲存，不恰當的保存方式可能造成熒光背景增加，標準曲線斜率降低，進而影響實驗精確度。試劑一般儲存在28。 (2)勿使用過期試劑。 (3)不同批次試劑不可混合或互換。 (4)開始檢測前，把試劑盒內所用的試劑和酶標板放置室溫平衡30分鐘。 (5)建議每塊酶標板都使用標準品和質控物(品)，并作雙孔。 (6)勿互換試劑瓶蓋。第53頁/共55頁注意事項 (7)從試劑瓶中轉移液體時，使用無菌的移液管以避免污染，否則由于試劑污染可能產生不正確的結果。 (8)檢測一旦開始，隨后的步驟應連續地進行下去，不要中斷。 (9)加樣時勿接觸孔壁，以避免孔間交叉污染。(

18、10)孵育時間的輕微變化是允許的，首次孵育和二次孵育許可時間分別為：3小時土10分鐘和1小時土5分鐘。 (11)使用過夜孵育過程，實驗結果可獲得較高的重復性。 (12)空氣的潔凈度可能影響實驗結果。第54頁/共55頁 第55頁/共55頁TSH單克隆抗體被測TSH抗原TSH單克隆抗體TSH單克隆抗體被測TSH抗原被測TSH抗原HPR標記的抗TSH亞基單克隆抗體HPR標記的抗TSH亞基單克隆抗體HPR標記的抗TSH亞基單克隆抗體HPR標記的抗TSH亞基單克隆抗體HRP被測TSH抗原被測TSH抗原HRPHRPHRPTSHTSH單克隆抗體的酶標反應孔內。（一步法）單克隆抗體的酶標反應孔內。（一步法）PH：6.5第10頁/共55頁原理 用熒光讀數儀以320nm為激發光，405nm為發射光測定熒光值。由于熒光強度與酶標反應板上結合的hTSH數量成正比，因此，通過已知濃度的標準血斑熒光值和樣本的熒光值，也就可換算出樣本血斑中hTSH的含量。第16頁/共55頁特點： 鑒于HPPA（3-P-羥基苯丙酸）敏感性高、動力學范圍廣，已被廣泛用于替代傳統EIA顯色劑，作為辣根過氧化物酶的底物。以HPPA作底物的FEIA可檢測極低和極高濃度，具有明顯優勢，由于hTSH樣本正常值與非正常值之間差異大，故該法特別適用于hTSH檢測。第18頁/共55頁以下儀器均由芬蘭Labsy