醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)第十章基因定位與基因克隆本章節(jié)重點(diǎn)基因定位和基因克隆的概念連鎖分析遺傳標(biāo)記基因定位的策略基因定位(genemapping)：利用一定的方法將一個(gè)基因確定到染色體上的實(shí)際位置上。1911年，Wilson將紅綠色盲基因定位到X染色體1968年，Duffy血型基因定位于1號(hào)染色體基因定位(genemapping)：利用一定的方法將一個(gè)基因確定到染色體上的實(shí)際位置上。基因克隆(genecloning)：用一定的方法把不同位點(diǎn)上的基因分離出來(lái)。連鎖分析(linkageanalysis)：利用被定位的基因與在同一染色體上另一遺傳座位相連鎖的特點(diǎn)，將該基因定位在某一染色體或染色體某一區(qū)帶上。第一節(jié)連鎖分析在基因定位中的作用連鎖分析(linkageanalysis)：利用被定位的基因與在同一染色體上另一遺傳座位相連鎖的特點(diǎn)，將該基因定位在某一染色體或染色體某一區(qū)帶上。第一節(jié)連鎖分析在基因定位中的作用連鎖分析(linkageanalysis)：利用被定位的基因與在同一染色體上另一遺傳座位相連鎖的特點(diǎn)，將該基因定位在某一染色體或染色體某一區(qū)帶上。第一節(jié)連鎖分析在基因定位中的作用連鎖分析(linkageanalysis)：利用被定位的基因與在同一染色體上另一遺傳座位相連鎖的特點(diǎn)，將該基因定位在某一染色體或染色體某一區(qū)帶上。第一節(jié)連鎖分析在基因定位中的作用重組值(recombinationfraction)：是基因定位時(shí)兩個(gè)基因間遺傳圖距的量度，即基因間的遺傳距離。

如果兩個(gè)基因之間有1％的重組值，其遺傳圖的距離就是1厘摩(centimorgan，cM)。第一節(jié)連鎖分析在基因定位中的作用遺傳標(biāo)記(geneticmarker)：基因定位是確定某一基因在染色體上的未知位置，用連鎖分析法進(jìn)行基因定位需要一些遺傳位點(diǎn)，這些位點(diǎn)應(yīng)按孟德爾方式遺傳，且具有多態(tài)性以顯示其連鎖關(guān)系，這些標(biāo)記位點(diǎn)稱為遺傳標(biāo)記。連鎖分析(linkageanalysis)：利用被定位的基因與在同一染色體上另一遺傳座位相連鎖的特點(diǎn)，將該基因定位在某一染色體或染色體某一區(qū)帶上。第一節(jié)連鎖分析在基因定位中的作用EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ3.0Kb1.7Kb探針第一節(jié)連鎖分析在基因定位中的作用神經(jīng)纖維瘤，NF1RFLP標(biāo)記ⅠⅡⅢ1212345678123456783.0Kb1.7Kb4.7Kb第一節(jié)連鎖分析在基因定位中的作用神經(jīng)纖維瘤，NF1RFLP標(biāo)記ⅠⅡⅢ1212345678123456784.7Kb3.0Kb第一節(jié)連鎖分析在基因定位中的作用神經(jīng)纖維瘤，NF1RFLP標(biāo)記ⅠⅡⅢ121234567812345678Lod法Lod(logarithmoftheodds)，是Morton在1955年提出的優(yōu)勢(shì)對(duì)數(shù)法。Lod分值為＋3，連鎖:不連鎖＝1000:1，表示連鎖存在第一節(jié)連鎖分析在基因定位中的作用Lod分值為－2，不連鎖:連鎖＝100:1，表示連鎖不存在第一節(jié)連鎖分析在基因定位中的作用多點(diǎn)連鎖定位(multipointlinkagemapping)利用三點(diǎn)交叉法(threepointcrosses)，可將某一致病基因定位于遺傳標(biāo)記的框架內(nèi)，更精確的進(jìn)行基因定位。第一節(jié)連鎖分析在基因定位中的作用多點(diǎn)連鎖定位(multipointlinkagemapping)子代類型重組位置數(shù)目ABC/abc非重組體853abc/abcABc/abc(A，B)-X-C5abC/abcaBC/abcA–X–(B，C)47Abc/abcAbC/abcB–X–(A，C)95aBc/abc第二節(jié)體細(xì)胞雜交與基因定位體細(xì)胞雜交(somaticcellhybridization)：又稱細(xì)胞融合(cellfusion)，是將兩個(gè)同種和/或不同種的細(xì)胞融合成一個(gè)新細(xì)胞，即雜種細(xì)胞(hybridcell)。病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞融合——仙臺(tái)病毒化學(xué)融合技術(shù)——聚乙二醇(PEG)電融合技術(shù)——電穿孔法細(xì)胞融合第二節(jié)體細(xì)胞雜交與基因定位細(xì)胞融合第二節(jié)體細(xì)胞雜交與基因定位異核細(xì)胞合核細(xì)胞第二節(jié)體細(xì)胞雜交與基因定位細(xì)胞融合兩個(gè)同種的動(dòng)物細(xì)胞融合后形成的雜種細(xì)胞，細(xì)胞核一般保留雙親的染色體；不同種動(dòng)物的細(xì)胞融合后，細(xì)胞核含有雙親的的染色體，但隨著增殖傳代的過(guò)程，會(huì)出現(xiàn)保留一方染色體，另一方染色體逐漸丟失的現(xiàn)象。第二節(jié)體細(xì)胞雜交與基因定位第二節(jié)體細(xì)胞雜交與基因定位HAT選擇系統(tǒng)

1962年，利用缺乏HPRT酶為遺傳標(biāo)記的人突變細(xì)胞株發(fā)展起來(lái)的HPRT系統(tǒng)；1964年，加入缺乏TK(胸苷激酶)的小鼠細(xì)胞株TK－系統(tǒng)，結(jié)合發(fā)展為HAT系統(tǒng)。第二節(jié)體細(xì)胞雜交與基因定位HAT選擇系統(tǒng)

H：次黃嘌呤(Hypoxanthine)A：氨基喋呤(Aminopterin)T：胸腺嘧啶(Thymidine)氨基喋呤阻斷DNA合成；融合細(xì)胞中含有TK和HPRT，可使次黃嘌呤轉(zhuǎn)變?yōu)榇吸S核苷酸，鳥嘌呤轉(zhuǎn)變?yōu)轼B苷酸。第二節(jié)體細(xì)胞雜交與基因定位雜種細(xì)胞的選擇和分離HPRT－TK－第二節(jié)體細(xì)胞雜交與基因定位TK－HPRT－第二節(jié)體細(xì)胞雜交與基因定位雜種細(xì)胞的選擇和分離基因產(chǎn)物的檢測(cè)與染色體定位TK：17號(hào)染色體第二節(jié)體細(xì)胞雜交與基因定位第二節(jié)體細(xì)胞雜交與基因定位基因產(chǎn)物的檢測(cè)與染色體定位微細(xì)胞融合(microcellfusion)第二節(jié)體細(xì)胞雜交與基因定位染色體畸變和區(qū)域定位(regionalassignment)第三節(jié)原位雜交和熒光原位雜交原位雜交(InSiteHybridization，ISH)：利用同位素標(biāo)記的DNA探針，與玻片上的中期染色體進(jìn)行雜交。是一種直接進(jìn)行基因定位的方法。熒光原位雜交(FISH)：用特殊的熒光素標(biāo)記DNA探針，與玻片上的染色體或細(xì)胞組織標(biāo)本進(jìn)行雜交。第三節(jié)原位雜交和熒光原位雜交X染色體Y染色體13號(hào)染色體18號(hào)染色體21號(hào)染色體第三節(jié)原位雜交和熒光原位雜交13號(hào)染色體21號(hào)染色體第四節(jié)放射雜種放射雜種(radiationhybrid)：用含有輻射切割的人類染色體片段的細(xì)胞與嚙齒類細(xì)胞融合產(chǎn)生的雜種克隆細(xì)胞，是體細(xì)胞雜種的另一種類型。1975年，Goss和Harris提出1990年，Cox構(gòu)建單染色體雜種細(xì)胞1994年，Walter建立全基因組放射雜種第四節(jié)放射雜種第四節(jié)放射雜種?Genebridge4

radiationdose:3,000Radsnumberofhybrids:93

averagefragmentsize:~10Mb第四節(jié)放射雜種HumanWhole-GenomePanels?StanfordG3

radiationdose:10,000Rads

numberofhybrids:83averagefragmentsize:~4Mb?StanfordTNG4(TheNextGeneration)

radiationdose:50,000Radsnumberofhybrids:90averagefragmentsize:~800kb/123456789101112ABCDEFG10000100000000001000001000000000100000000000000001000000000000000000000010001000000

10000100000000001000001000000000100000000000000001000000000000000000000010001000000

第四節(jié)放射雜種第五節(jié)基因克隆一、功能克隆(functionalcloning)先研究功能，再定位克隆基因。血紅蛋白病HbS——血紅蛋白缺陷(1949)

——β鏈

谷氨酸6纈氨酸

GAG→GTG

——11p(70年代)第五節(jié)基因克隆第五節(jié)基因克隆第五節(jié)基因克隆二、定位克隆(positionalcloning)ATGGTCTCACTGCAACCGATGGTCTCACTGTAACCG