1、廣西一點(diǎn)紅總生物堿的提取和抗菌活性研究(一)作者：周吳萍 韋媛媛 李軍生 閻柳娟 賴雪芬【摘要】 目的考察廣西一點(diǎn)紅總生物堿的分離提純及其抗菌活性。方法通過(guò)95乙醇回流提取一點(diǎn)紅藥材中的生物堿類物質(zhì)，利用酸水提取法及有機(jī)溶劑萃取對(duì)其進(jìn)行分離純化，同時(shí)用化學(xué)檢識(shí)法與薄層色譜法進(jìn)行定性鑒別。采用濾紙片法研究一點(diǎn)紅生物堿類物質(zhì)的抗菌活性。結(jié)果一點(diǎn)紅生物堿濃度在600800 mg/ml時(shí)對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及枯草桿菌中度敏感，隨著藥物(生物堿)濃度的增大，抗菌作用越明顯。結(jié)論說(shuō)明一點(diǎn)紅生物堿類物質(zhì)對(duì)供試菌有一定的抑菌活性。 【關(guān)鍵詞】 一點(diǎn)紅 總生物堿 提取分離 抗菌活性Abstract：Obj

2、ectiveTo investigate the extraction and separation methods and antibacterial activities of the alkaloids in Emilia sonchifolia from Guangxi.MethodsThe alkaloids in Emilia sonchifolia were reflux extracted by 95% alcohol, and separated by acid water extraction and organic solvent extraction method, a

3、t the same time qualitative identification was performed by the chemical methods and the thin layer chromatography methods. To study the antibacterial activities of the alkaloids in Emilia sonchifolia by filter paper method. Results The result showed it was medium sensitive to Escherichia coli, Baci

4、llus subtilis and Staphylococus aureus when the concentrations of the alkaloids were in the range of 600800 mg/ml. The antibacterial function was more remarkable with the medicine concentrations increased. ConclusionThe alkaloids of Emilia sonchifolia has certain antibacterial activities against the

5、 selected microbes.Key words：Emilia sonchifolia; Total alkaloids; Extraction-Separation; Antibacterial activity一點(diǎn)紅Emilia sonchifolia (Linn.) DC屬菊科植物一點(diǎn)紅的干燥全草，主產(chǎn)于廣東、廣西、福建、貴州、江西，具有清熱解毒、活血散瘀的功效，用于治療急性扁桃體炎、肺炎、急性闌尾炎、傳染性肝炎、痢疾、尿路感染等疾病1。一點(diǎn)紅是婦科臨床常用藥廣西特產(chǎn)中成藥花紅片的主要原料藥2，其主要含有黃酮類3，生物堿類1，甾醇類4等化學(xué)成分。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，一點(diǎn)紅提取物有一定的抗

6、氧化和抗炎作用5，6，并且對(duì)金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和痢疾桿菌有一定抑制作用1。國(guó)內(nèi)外僅對(duì)一點(diǎn)紅的種植和臨床應(yīng)用方面有少量研究，對(duì)活性成分抗菌性能未見有相關(guān)報(bào)道，而生物堿常常是很多中草藥的有效成分，具有抗炎抗菌的藥理作用。故實(shí)驗(yàn)分離提純一點(diǎn)紅總生物堿類物質(zhì)，進(jìn)行體外抗菌活性研究，為尋找一點(diǎn)紅抗菌的活性成分提供一定參考，為有效利用廣西草藥資源提供依據(jù)。1 材料與方法1.1 材料 中藥一點(diǎn)紅干燥全草(由廣西花紅藥業(yè)提供)，陽(yáng)性對(duì)照硫酸鏈霉素粉針劑（購(gòu)自柳州市中醫(yī)院），甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、醋酸乙酯、環(huán)己烷等試劑均為分析純。供試菌種：大腸桿菌Escherichia coli，枯草芽孢桿菌Bacil

7、lus subtilis，金黃色葡萄球菌Staphylococus aureus，以上菌種由廣西工學(xué)院生物與化學(xué)工程系微生物實(shí)驗(yàn)室提供。培養(yǎng)基：營(yíng)養(yǎng)瓊脂粉，營(yíng)養(yǎng)肉湯。1.2 一點(diǎn)紅生物堿的提取分離稱取一點(diǎn)紅藥粉約100 g，加95%乙醇1 000 ml水浴回流提取2 h，減壓抽濾得到提取液，藥渣加入新溶劑反復(fù)提取3次，合并提取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收乙醇，揮干溶劑得到生物堿粗提物浸膏。浸膏加1%鹽酸溶解，減壓過(guò)濾，濾液用氯仿萃取至氯仿層無(wú)色，棄去氯仿層，水層用10%氨水調(diào)節(jié)pH值為911，用氯仿萃取3次，合并氯仿層(加入少量K2CO3，脫水)，回收氯仿得到總生物堿提取物，干燥稱重，計(jì)算提取率，產(chǎn)品

8、于干燥器中保存。在提取與純化過(guò)程中適時(shí)用生物堿檢測(cè)試劑同時(shí)追蹤檢識(shí)生物堿。1.3 生物堿的鑒別取出待測(cè)液各1 ml置于試管中分別做生物堿、黃酮及甾醇類物質(zhì)的化學(xué)檢識(shí)試驗(yàn)7。將所提得樣品溶解于無(wú)水乙醇中，點(diǎn)樣于硅膠G薄層色譜板上，分別采用環(huán)己烷甲醇（91）；醋酸乙酯甲醇氨水（910.3）及丙酮三個(gè)極性大小不同的展開系統(tǒng)對(duì)一點(diǎn)紅生物堿提取物進(jìn)行薄層色譜分離，用碘化鉍鉀試劑顯色，電吹風(fēng)吹干，觀察現(xiàn)象。1.4 體外抑菌實(shí)驗(yàn)生理鹽水:稱取0.9 g氯化鈉，加100 ml蒸餾水溶解，于121,0.1 MPa條件下，滅菌20 min。2 結(jié)果2.1 一點(diǎn)紅總生物堿提取率及鑒別結(jié)果95%乙醇回流提取的平均提取

9、率為0.17。同法提取的4份提取物用3種典型的生物堿試劑進(jìn)行化學(xué)檢識(shí)均呈明顯的生物堿陽(yáng)性反應(yīng)，同時(shí)進(jìn)行黃酮，甾醇類物質(zhì)的檢識(shí)均呈陰性反應(yīng)。通過(guò)采用3個(gè)不同極性展開系統(tǒng)的薄層色譜鑒別，可以看出1，3號(hào)樣品有明顯的拖尾現(xiàn)象，2，4號(hào)樣品為清晰的單一斑點(diǎn)，選用分離純度較高的樣品進(jìn)行抗菌試驗(yàn)。結(jié)果見圖1。2.2 一點(diǎn)紅生物堿的抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果藥敏試驗(yàn)判斷標(biāo)準(zhǔn)以抑菌圈大小為依據(jù)，抑菌圈大于20 mm為高度敏感，1020 mm為中度敏感，10 mm以下為低度敏感。一點(diǎn)紅生物堿對(duì)3種菌有一定的抑制作用，濃度在400800 mg/ml之間時(shí)金黃色葡萄球菌及大腸桿菌的抑菌圈介于1020 mm之間，屬于中度敏感。生物

10、堿濃度在600800 mg/ml之間對(duì)枯草桿菌中度敏感。結(jié)果顯示一點(diǎn)紅生物堿類物質(zhì)對(duì)3種細(xì)菌的抑菌強(qiáng)度沒(méi)有太大差異。3 討論3.1 生物堿的提取鑒定曾試用丙酮作為回流提取劑，平均提取率為0.16，低于乙醇。由于氯仿、丙酮、乙醚和甲醇具有一定毒性，乙醇毒性較小且提取率較高，故實(shí)驗(yàn)選用95%乙醇對(duì)一點(diǎn)紅進(jìn)行生物堿提取。回收溶劑后得到生物堿粗品，利用生物堿在酸性條件下成鹽溶于酸水的特性，加入氯仿去除脂溶性雜質(zhì)，再將酸水液堿化使生物堿游離，利用游離生物堿一般溶于脂溶性有機(jī)溶劑的性質(zhì)，用氯仿將其萃取出來(lái)，去除水溶性雜質(zhì)。實(shí)驗(yàn)中分離提純得到的幾個(gè)樣品經(jīng)化學(xué)檢識(shí)和薄層色譜鑒別后確定為生物堿類物質(zhì)，由于一點(diǎn)紅

11、主要含有黃酮、生物堿、甾醇等成分，同時(shí)檢識(shí)樣品中的黃酮、甾醇成分均呈陰性結(jié)果。2號(hào)和4號(hào)樣品在3個(gè)不同極性的展開系統(tǒng)下均為單一清晰的薄層色譜斑點(diǎn)，說(shuō)明分離得到的總生物堿較純，用此法分離提純生物堿類成分較好。3.2 體外抗菌實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)中排除了抗菌實(shí)驗(yàn)的相應(yīng)干擾。不加菌液的陰性對(duì)照培養(yǎng)皿無(wú)菌落生長(zhǎng)，說(shuō)明全過(guò)程無(wú)菌技術(shù)的可靠性較強(qiáng)；在無(wú)抗菌藥物的培養(yǎng)基上實(shí)驗(yàn)菌生長(zhǎng)良好，說(shuō)明所配制培養(yǎng)基無(wú)質(zhì)量問(wèn)題；實(shí)驗(yàn)用0.25硫酸鏈霉素溶液作為陽(yáng)性對(duì)照，該已知抗菌藥物對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株出現(xiàn)了預(yù)期的抗菌效果；無(wú)菌水的空白對(duì)照無(wú)抑菌圈；10的吐溫溶液的溶劑對(duì)照無(wú)抑菌圈，說(shuō)明溶解樣品的溶劑無(wú)抗菌作用；同時(shí)測(cè)定生物堿待測(cè)液的pH值為78之間，排除了藥物本身pH