1、抗菌藥物誘導性腸球菌耐藥的實驗研究*    關鍵詞： 腸球菌     【摘要】 目的 深入研究腸球菌耐藥性的產生機制，指導臨床合理用藥。方法 采用一步誘導法，對8株糞腸球菌、2株屎腸球菌和9株糞腸球菌、1株屎腸球菌進行四環素和左氧氟沙星誘導性耐藥試驗。對誘導出的菌株用瓊脂稀釋法測定藥物敏感性；用PCR法檢測四環素耐藥基因tetM、tetL，用PCR法擴增gyrA、parC基因后測定DNA序列。結果 10株實驗菌中的2株誘導產生了多株穩定的四環素耐藥株。耐藥株的MIC分別為16128g/ml，與原株（MIC0.25g

2、/ml、2g/ml）比較，增加了16512倍。在1株實驗菌的誘導耐藥株的質粒DNA上檢測到tetL耐藥基因，另一株實驗菌株的誘導耐藥株的染色體DNA上檢測到tetM耐藥基因；10株實驗菌中的2株誘導產生了多株穩定的左氧氟沙星耐藥株。誘導耐藥株的MIC分別為1664g/ml，與原株（MIC 2g/ml、2g/ml）比較，增加了832倍。GyrA的QRDR內的第87位或第83位的氨基酸及ParC的 QRDR內的第80位的氨基酸均發生了改變。結論 一步法抗菌藥物誘導性耐藥試驗的結果表明，腸球菌可在高于耐藥MIC濃度的抗菌藥物短期作用后獲得耐藥性。    【關鍵

3、詞】    腸球菌 抗菌藥物 誘導性耐藥 抗菌藥物壓力    Laboratory study of antibacterial agents on enterococcus induced resistance     【Abstract】 Objective The purpose of the present research was to study on the emergence mechanism of enterococcal resistance to a

4、variety of antibacterial agents，and to guide the selection and use of antimicrobial agents in clinical practice.Methods Eight of faecalis enterococcus and two of faecalis enterococcus，nine of faecalis enterococcus and one of faecium enterococcus were selected to performed experiments on induced resi

5、stance to tetracycline、levofloxacin respectively by one-step method.The susceptibility of the induced strains resisitant to tetracycline、levofloxacin was measured by determining the MIC using agar dilution method. The tetM and tetL gene in the induced strains were detected by PCR， gyrA and parC gene

6、 were amplified by using PCR，then the nucleotide sequence of two genes were analysed.Results Some strains stably resistant to tetracycline were obtained from 2 of 10 test strains，the MICs of these laboratory resistant strains were 16128g/ml.with 16-fold512-fold increase when compared with parental s

7、trains (MIC 0.25g/ml、2g/ml， respectively). The gene of tetL was detected in the plasmid DNA of one test strain and its laboratory resistant strains. The gene of tetM was detected in the chromosome DNA of the laboratory resistant strains from another one test strain. Some strains stably resistant to

8、levofloxacin were obtained from 2 of 10 test strains.The MICs of the laboratory stains were 1664g/ml，with 832 times higher than that of the parental strains (MIC 2g/ml、2g/ml respectively). Neucleotide sequence analysis and comparison of the derived amino acid sequence revealed that GyrA had a substi

9、tution at position 83 and 87 in laboratory resistant strains.The alterations in ParC at position 80 were observed in all laboratory resistant strains.Conclusion The results of in vitro experiments on enterococcal strains for induced resistance to tetracycline and levofloxacin，which were performed by

10、 one-step method，show that acquired resistance could be occurred when exposuring them to high level of some antibacterial agents for short term.     【Key words】 enterococcus antibacterial agents induced resistance antibacterial pressure    近年來，腸球菌作為一種引起醫院感染的重要

11、病原菌已經引起了醫學界的廣泛關注。美國醫院感染監視系統(NISS)已將其列為引起醫院感染的第二大病原菌1。    腸球菌不僅具有天然耐藥性，而且更易被誘導產生新的耐藥性。Tankovic報告對環丙沙星耐藥的腸球菌由19871989年期間的不到2%增加到19911993年間的14%以上，而且是由該類藥物在臨床上的應用增加所致2。在瑞典Huddinge醫院，對喹諾酮耐藥的腸球菌由1994年的11%增加到1997年的25%3。而國內19972001年期間臨床分離的腸球菌對環丙沙星耐藥率分別為糞腸球菌44.2%，屎腸球菌70.7%4。在美國，由于萬古霉素的使用，

12、19891993年間腸球菌對萬古霉素的耐藥率增加了20倍。這些統計學臨床資料已經顯示，抗菌藥物的臨床應用造成的藥物選擇性壓力可能是引起腸球菌耐藥性的產生與擴散的重要原因之一。    為深入探索腸球菌耐藥性的產生和發展，本課題就此進行了部分抗菌藥物的實驗研究。    1 材料與方法    1.1 材料    1.2 方法    2 結果    2.1 四環素誘

13、導性耐藥試驗結果    表1 四環素誘導的菌株的耐藥性注：TE521、TE522、TE821、TE822分別為實驗菌株TE5和TE8的48h誘導耐藥株；TE531、TE831、TE532、TE832分別為實驗菌株TE5和TE8的72h誘導耐藥株。     2.2 左氧氟沙星誘導耐藥性試驗結果    表2 左氧氟沙星誘導的菌株的耐藥性注：LE121、LE131、LE141分別為實驗菌株LE1在48h、72h和96h誘導培養后生長的菌株；LE521、LE531、LE541分別為實

14、驗菌株LE5在48h、72h和96h誘導培養后生長的菌株。    表3 左氧氟沙星誘導的耐藥菌株的gyrA序列改變        表4 左氧氟沙星誘導的耐藥菌株的parC序列改變3 討論     在一步法抗菌藥物誘導性耐藥試驗中，分別接種了1×107CFU實驗菌于含高于耐藥MIC濃度的左氧氟沙星BHI瓊脂平板和四環素BHI瓊脂平板上，實驗菌株在24h培養后均無肉眼可見的菌落生長，表明腸球菌對左氧氟沙星和四環素耐藥菌株的自發突變

15、率一般低于1×10-7。48h后誘導生長的菌株再次接種含抗菌藥物BHI瓊脂平板，則于24h培養后生長成菌膜，表明為非緩慢生長的腸球菌。實驗菌株和ATCC29212接種在35已預先放置了24120h的含抗菌藥物BHI瓊脂平板上，培養24h后無菌落生長，示誘導生長的菌株不是因為培養基中的抗菌藥物活性下降所致。藥物敏感性測定結果表明誘導后生長的菌株均單獨對左氧氟沙星或四環素耐藥。以上結果表明分別在含左氧氟沙星或四環素的BHI瓊脂平板上，于48h后生長的菌株均應為藥物誘導產生的耐藥菌株。    腸球菌對喹諾酮類藥物耐藥的主要機制是由于DNA促旋酶A亞單

16、位（gyrA）和拓撲異構酶（parC）基因突變引起。一般認為parC為腸球菌對喹諾酮類藥物耐藥的第一突變基因，低中水平耐藥一般僅有parC突變，高水平耐藥常既有parC突變，又有gyrA的突變，尚未發現僅有gyrA突變而無parC突變的腸球菌耐藥菌株。本實驗中誘導的耐藥株未見gyrA編碼的蛋白質QRDR內的第83和87位氨基酸，或parC 編碼的蛋白質QRDR內的第80和84位氨基酸同時發生改變的誘導耐藥株。此結果與文獻報道類似7。    腸球菌對四環素的主要耐藥機制為產生外排蛋白和核糖體保護因子，其中最主要、最常見的2種耐藥決定子為tetL、tetM。本實驗誘導的四環素耐藥株的PCR擴增結果顯示，TE8實驗株的誘導耐藥株全部含有tetM耐藥決定子，而未檢測到tetL耐藥確定子。TE5實驗株及其誘導耐藥株全部檢測到tetL，而未檢測到tetM。TE5實驗株為四環素敏感菌株，其MIC為0.25g/ml，但在其質粒中檢測到tetL耐藥決定子，此種基因型和耐藥表型不一致的現象尚未見報道。推測可能為某種因素抑制了tetL的表達，經四環素作用后，解除了對tetL表達的抑制，進而對四環素產生耐藥。    本研究中對誘導的耐藥菌株