1、核酸分子雜交,核酸分子雜交：來源相同或不同的DNA甚至DNA與RNA分子變性后，在合適的條件下通過堿基互補形成雙鏈雜交體的過程稱核酸分子雜交(molecular hybridization)。核酸分子雜交技術是目前生物化學和分子生物學研究中應用最廣泛的技術之一，也是臨床分子檢驗的重要技術,核酸探針的標記,探針(probe)是指用放射性核素或其它標記物標記的核酸片段,標記物,放射性標記,非放射性標記,生物素標記,地高辛標記,熒光素標記,探針的種類,DNA探針：雙鏈或單鏈DNA探針是最常用的核酸探針。長度在幾百堿基對以上。DNA探針又分為： 基因組DNA探針：有細菌、病毒、原蟲、真菌、動物和人類細

2、胞DNA探針，多為某一基因的全部或部分序列，或某一非編碼序列。 cDNA探針：以mRNA為模板經過逆轉錄酶催化產生的互補于mRNA的DNA鏈,探針的種類,DNA探針優點： 1、一般克隆在質粒載體中，可以無限繁殖； 2、DNA探針不易降解 3、DNA的標記方法比較成熟,探針的種類,RNA探針：可以是標記分離的RNA，也可以是重組質粒在RNA聚合酶作用下的轉錄產物。其優點是： RNA探針為單鏈，復雜性低，與靶序列雜交反應效率極高 因不存在重復序列，因此特異性高 本底低 缺點,探針的種類,寡核苷酸(oligo)探針：由1750mer組成的短探針。 優點： 可根據需要人工合成相應的序列； 因片段短，只

3、有一個核苷酸突變，其Tm值也有明顯變化，特別適用于點突變的檢測 雜交速度快特異性強 缺點：所帶標記物少靈敏度低；片段短雜交體不穩定,探針的標記,切口平移法 標記原理：是目前實驗室是最常用的一種脫氧核糖核酸探針標記法。利用大腸桿菌DNA聚合酶1的多種酶促活性將標記的dNTP摻入新合成DNA鏈中使探針被標記。 帶缺口(nick)的線狀、超螺旋及環狀雙鏈DNA均可作為切口平移法的模板,DNase I,DNA Pol I,-32P-dNTP,標記步驟,1、取1gDNA溶于少量無菌蒸餾水中 2、加入l10 x切口平移緩沖液，混勻 10 x切口平移緩沖液 0.5mol/L Tris.Cl(pH7.2) 0

4、.1mol/L MgSO4 1mmol/L 二硫蘇糖醇(DTT) 500g/ml 牛血清白蛋白,標記步驟,3、加入除標記核苷酸外的其他三種脫氧核糖核苷酸溶液(也可以是多種標記核苷酸)，20mmol/L溶液各1l。 以下操作要在同位素工作室中有防護措施的情況下進行操作 4、加入100Ci(10l)標記的核苷酸溶液。注：應貯存在20oC冰箱中，使用前在室溫下放置1530分鐘融化。要盡量減少凍融次數,標記步驟,5、加入無菌蒸餾水，至終體積為46.5l，混勻 6、加入0.5l稀釋的DNase I溶液，混勻 7、加入1l(5U)DNA聚合酶I溶液，混勻 注：以上操作均在冰浴中進行 8、置1416oC水浴

5、中保溫12小時 9、加入2l 0.5mol/L EDTA終止反應 10、純化標記的DNA探針,單鏈DNA探針的標記,探針的標記,隨機引物法 標記原理：隨機引物是含有各種可能排列的寡聚核苷酸片段的混合物，可以與任何核酸序列雜交，起到聚合酶促反應的引物作用。將待標記的探針模板與隨機引物一起退火，合成標記探針,標記步驟,1、冰浴中，在一微量離心管內順序加入下列溶液，并混勻 20mmol/L DTT 1l 5mmol/L dATP、dGTP、dTTP 1l 10 x隨機引物緩沖液 1l 標記dCTP 3l 水 1l,標記步驟,2、取200ng雙鏈DNA溶于1l蒸餾水中，在蠟膜上與1l隨機引物充分混勻，

6、吸入一毛細玻璃管中，用火封嚴兩端。置沸水浴中30分鐘并迅速置冰水浴中1分鐘。將DNA轉入上述離心管中 3、加入1l(5U)DNA聚合酶Klenow片段，混勻并離心，室溫反應3小時以上,標記步驟,4、取10l終止緩沖液，置20oC保存備用 終止緩沖液 50mmol/L Tris.Cl(pH7.5) 50mmol/L NaCl 5mmol/L EDTA 0.5% SDS,隨機引物標記法特點,1、除能進行雙鏈DNA標記外，也可用于單鏈DNA或RNA探針的標記。當用RNA為模板是，操作方法同上，但必須采用反轉錄酶。 2、標記活性高，只需25ng樣品DNA，可在3小時內使4060以上甚至90的標記dNT

7、P摻入到探針DNA鏈上 3、操作方便,3末端標記,末端標記屬于部分標記。特點是可得到全長DNA片段，但標記活性不高。3末端標記法包括限制酶切和聚合酶合成兩個過程，3標記有兩種方式,大腸桿菌DNA聚合酶I Klenow片段末端標記法,T4DNA聚合酶標記法,大腸桿菌DNA聚合酶I Klenow片段末端標記法,標記反應步驟,1)在反應管中依次加入下列試劑并混勻,DNA 1g,10 xKlenow片段緩沖液 2l,2mmol/L3種dNTP(無dATP) 1l,32PdATP 30Ci,加水至 25l,10 xKlenow片段緩沖液 2l,0.5mol/L Tris.Cl(pH7.2,0.1mmol

8、/L MgSO4,1mmol/L DTT(二硫蘇糖醇,500g 牛血清白蛋白,2)加入1單位Klenow聚合酶片段，室溫反應30min,3)加入12l0.5mol/LEDTA以終止反應。酚/氯仿抽提1次,4)Sephadex G50柱層析或乙醇沉淀法分離標記的DNA片段,大腸桿菌DNA聚合酶I Klenow片段末端標記法,注意事項,1)要根據不同限制酶產生的不同粘性末端選擇不同的標記核苷酸,2)選擇適當的限制酶及-32P-dNTP,利用DNA聚合酶I Klenow片段的末端填充活性，可以選擇性地將DNA雙鏈之中一條鏈特異地標記,3)此方法不能直接用于3凸出末端DNA的標記,加入DNA聚合酶，d

9、NTP(其中一種為標記核苷酸,AATTC,CCTAGG,T4DNA聚合酶標記法,T4DNA聚合酶具有兩種功能，53聚合活性 和35外切活性。當反應體系中缺乏dNTP時，T4DNA聚合酶主要表現為外切酶活性。利用這一特性可產生5凸出的DNA片段，然后加入dNTP，其中之一為標記核苷酸，在T4DNA聚合酶活性的作用下，合成出標記探針,標記反應步驟,1)在反應管中加入下列試劑并混勻,DNA 0.20.5g,1xT4DNA聚合酶緩沖液 2l,加水至 20l,2)加入所需的限制酶，并在適當條件下溫育,3)加入適量T4DNA聚合酶,4)當切除了所需數量的核苷酸后，加入 1l2mmol/L四種核苷酸(其中一

10、種為標記核苷酸)，37oC保溫一小時,5)Sephadex G50柱層析或乙醇沉淀法分離標記的DNA片段,5末端標記,標記原理：在T4多核苷酸激酶的催化下，可使 ATP分子上的磷酸基團轉移到DNA或RNA分子的5OH基團上。因此采用-32P-ATP為底物，即可將DNA樣品5端標記。但核酸樣品5端必需是去磷酸的,標記反應步驟,1)堿性磷酸酶的預處理：堿性磷酸酶(CIP)硫酸銨懸液4oC下在Eppendorf離心管中離心1分鐘。棄上清，沉淀重溶于少量水中。4oC下此溶液可保存一個月以上,2)將DNA樣品溶解于少量10mmol/L tris.Cl(pH8.0)溶液中，然后加入,10 xCIP緩沖液

11、5l,CIP緩沖液 適量,加水至 48l,置37oC30分鐘。加入第二份CIP，繼續保溫30分鐘，即可脫去5端磷酸基團。0.01U的CIP，可脫去1pmol5磷酸基團(1.6g4kb線性DNA的5端數相當于1pmol,10 xCIP緩沖液 Tris.Cl(pH9.0,10mmol/L MgCl2,1mmol/L ZnCl2,10mmol/L 亞精胺,3)加入40l H2O，10l 10 xSTE，5l 10SDS。加熱至68oC，15分鐘,10 xSTE,100mmol/L Tris.Cl(pH8.0,1mol/L NaCl,10mmol/L EDTA,酚/氯仿及氯仿各抽提兩次除CIP，Sep

12、hadexG50層析脫鹽后乙醇沉淀。取脫鹽后的脫5磷酸DNA150pmol溶于少量水中，然后加入下列試劑進行5末端標記,加水至50ul，混勻，37oC保溫1小時。加入2ul0.5mol/LEDTAz終止反應，酚/氯仿抽提后乙沉淀。SephadexG50層析分離后得5標記的DNA探針,32P-ATP 50pmol(150uCi,T4多核苷酸激酶 1020U,10 x激酶緩沖液 10ul,注意事項,1)T4多核苷酸激酶對多種雜質非常敏感，要求必需達到一定的純度；脫磷酸后要用SephadexG50層析除去小分子及離子,2)亞精胺即可促進-32P-ATP的摻入，又能抑制核酸酶的活性,3)脫磷酸的DNA

13、樣品最好經電泳純化以除去其中存在的低分子質量的核酸，否則會競爭性抑制目標DNA的標記,探針的線純化,凝膠過濾柱層析法,利用凝膠的分子篩效應，將標記的DNA與小分子彼此分開。因標記的探針量很小，一般用離心柱層析法,乙醇沉淀法,核酸分子雜交的種類和方法,核酸分子雜交的基本原理：DNA分子由兩條互補的單鏈形成的雙螺旋結構。維持結構穩定的力有三：1、兩條鏈間互補堿基的氫鍵；2、堿基間的堆積力(范德華力)；3、中和鏈內的負電荷,變性：在理化因素作用下，雙螺旋結構間的氫鍵斷裂，兩條鏈解開形成單鏈的過程,變性溫度(Tm)：核酸分子熱變性時，從開始變性到變性結束，是在一個很窄的溫度范圍內進行的，當變性進行到核

14、酸分子解鏈一半時的溫度，稱變性溫度，也稱融解溫度,影響變性的因素,1、堿基組成 DNA分子中GC含量越高Tm越高。在1SSC溶液中，兩者之間的關系可以用經驗公式表示,Tm(G+C)%0.41+69.3,其中，69.3為無GC存在時的Tm值。(G+C)%每增加1，Tm約上升0.41oC,影響變性的因素,2、溶液的離子強度 DNA鏈骨架上的磷酸基團帶有較多的負電荷，它們之間的靜電相斥作用是其雙鏈的不穩定因素之一。在無鹽的水中，DNA在室溫下就會變性，加入鹽后，正離子可以封閉磷酸基團的負電荷，使DNA穩定性增加，Tm值升高,影響變性的因素,3、pH值 pH值在59范圍內，Tm值變化不明顯。在高pH值

15、下，可使堿基失去形成氫鍵的能力。當pH大于11.3時所有氫鍵均被破壞，DNA完全變性,4、變性劑 可以干擾堿基堆積力和氫鍵的形成，因此可以降低Tm值。常用的變性劑是甲酰胺和脲，通常用50的甲酰胺以使Tm值降低30 oC,復性：變性核酸分子在合適的條件下重新形成雙螺旋結構的過程稱復性。熱變性的DNA溶液在低于Tm值25 oC的溫度下維持相當長的一段時間，則可使之恢復到天然的雙鏈結構狀態。復性的速度受以下因素影響,1、DNA濃度 DNA濃度越大復性速度越快,2、DNA的分子質量 大分子質量的DNA擴散速度慢，復性速度慢,3、溫度 溫度過高，有利于DNA變性而不利于復性,4、離子強度,5、DNA分子

16、的復雜性 DNA總量一定時，基因組越復雜，其中特定順序的拷貝數越少，互補順序的濃度越低，復性反應速度越慢,分子雜交技術就是利用了核酸分子的變性與復性原理，使變性的核酸分子與檢測核酸分子在堿基互補的條件下形成雜交雙螺旋的過程,探針(probe)：在核酸變性實驗中，為使雜交體與單鏈核酸分子區分開來所使用的帶有標記的單鏈核酸分子,核酸分子雜交分類,以雜交分子分類：DNA與DNA雜交；DNA與RNA雜交；RNA與RNA雜交,以探針標記分類,以雜交介質分類：液相雜交與固相雜交,固相雜交：菌落雜交、Southern印跡雜交、Northern印跡雜交、原位雜交及基因芯片等技術,液相雜交(solution h

17、ybridization)：是一種比較原始的分子雜交技術。待測分子與探針在雜交液中完成反應，利用層析方法將雜交分子與末雜交分子分開后用液閃儀進行計數或利用紫外吸收特性變化分析雜交結果的分子雜交類型。液相雜交又分為：RNA酶保護分析法、核酸酶S1保護分析法,RNA酶保護分析法(RPA)：利用RNase A和RNase T1能專一性降解單鏈RNA而雙鏈RNA受到保護的特點，用體外轉錄合成的放射性標記的RNA探針與待檢mRNA 進行液相雜交，使互補序列RNA探針和待測RNA形成雜交體，用RNase降解非雜交部分RNA后分析雜交結果,RNA酶保護分析法的應用,mRNA定量,mRNA未端定位,內含子在相

18、應基因中的位置,RNA酶保護分析法的主要步驟,1、制備待測RNA 從細胞或組織中提取總RNA或mRNA,2、RNA探針標記 采用體外轉錄的方法制備和標記探針,3、分子雜交：將待測樣品RNA和RNA探針在液相中雜交，雜交前將樣品和探針變性，破壞二級結構,4、RNA酶消化單鏈RNA,5、電泳分析雜交分子,核酸酶S1保護分析法(nuclease S1 protection assay)：原理與RNA酶保護分析法的原理類似，核酸酶S1能專一性地降解單鏈DNA和RNA，而不能降解DNA/RNA雜交雙鏈。采用M13體系克隆和擴增特定基因的單鏈DNA片段，在合成過程中加入核素標記物，即可合成出高放射性的單鏈

19、DNA探針。將探針與待測RNA樣品在液相中進行雜交，形成DNA/RNA雜交雙鏈。酶解后進行分析,核酸酶S1保護分析法可用于基因轉錄起始位點分析及內含子剪切位點分析,液相雜交的優點,設備簡單、操作方便,液相雜交的缺點,過量未雜交探針難以除去，產生高背景；同源與異源核酸均可形成雙螺旋結構使得雜交結果難以分析,固相雜交：將欲分析的樣品先結合在固相支持物上，再與探針進行雜交反應。雜交結果可用儀器或放射自顯影技術分析雜交結果,固相支持物的選擇：可用于固相支持物的種類很多。一種良好的固相支持物應具備以下幾個特性,1、具有較強的結合核酸分子的能力；2、與核酸分子結合后不影響與探針的結合,3、與核酸分子的結合

20、穩定牢固,4、非特異性吸附少,5、具有良好的機械性能便于操作,硝酸纖維素濾膜,優點：具有較強的吸附單鏈DNA或RNA的能力，特別是在高鹽濃度下，其結合能力可達80100 g/ cm2。吸附的單鏈核經真空烘烤后，依靠疏水性相互作用而結合在硝酸纖維素膜上。硝酸纖維素膜具有雜交信號本底低的特點廣泛用于各種雜交實驗。缺點：與單鏈核酸的結合能力不十分牢固，尤其是小于200bp的DNA片段，洗膜時(特別是在高溫下)DNA會出現脫膜現象，硝酸纖維素膜質地較脆使操作不便,尼龍膜：是目前較理想的一種核酸固相支持物，它有多種類型，不同類型的膜上網孔大小不同。經正電荷基團修飾后與核酸的結合力更強,尼龍膜與核酸的結合

21、能力為350500 g/ cm2。經烘烤或紫外線照射后，特別是紫外線照射，核酸中的部分嘧啶堿基可與膜上帶正電荷的基團相互交聯，使結合更加牢固,Southern印跡雜交,Southern 印跡雜交過程,1、DNA樣品的酶切和電泳,2、電泳膠的處理,3、DNA的轉移,4、DNA的固定,5、DNA膜的雜交,雜交過程,1、預雜交：為了減少非特異性雜交反應，在雜交前應進行預雜交，將非特異性DNA位點封閉。常用的封閉物有兩類：其一是變性的非特異性DNA，大多采用鮭魚精子DNA或小牛胸腺DNA；其二是一些高分子化合物，其作用有二：封閉DNA上的非特異位點；封閉膜上與非特異性DNA結合位點,預雜交液的配制,6

22、SSC（1SSC為0.15mol/L NaCl和 o.o15mol/L檸檬酸,5Denhardts溶液,0.5SDS,100g/ml變性的鮭魚精子DNA,50甲酰胺(可不用,50Denhardt,聚蔗糖(Ficoll 400) 5g,聚乙烯吡咯烷酮 5g,牛血清白蛋白(組分V) 5g,加水至500ml，分裝后保存于20oC,10mg/ml鮭魚精DNA：超聲法或用注射器通過6號針頭反復抽打將DNA打斷。煮沸后置20oC保存，使用前置沸水浴中煮沸5分鐘后速置冰浴中,甲酰胺：使用前用Dowex XG8混合床陰陽離子交換樹脂處理1小時，小量分裝后置70oC保存,膜的處理：將結合了DNA(或RNA)的硝

23、酸纖維素膜或尼龍膜浸泡于6SSC溶液中2分鐘，使其充分濕潤,預雜交：將濕潤的濾膜放入一塑料袋中，按每平方厘米膜0.2ml量加入預雜交液，盡量排除其中的氣泡后用封口機封口,溫育：將雜交袋浸入適當溫度的恒溫水浴中(不加甲酰胺時用68oC；加入50甲酰胺時，恒溫42oC)，溫育12小時，也可延長至1216小時。保溫過程中應不斷搖動塑料袋，以趕走蓋在濾膜表面的氣泡，否則這些氣泡將阻礙雜交液與濾膜的接觸。(如果將預雜交液加熱到適當溫度后再加入塑料袋內，可以減少氣泡產生,2、雜交：雜交反應是單鏈核酸探針與待測核酸分子中的特異基因序列在一定的溫度下雜交復性的過程。雜交包括以下過程,1、雜交液配制：同預雜交液

24、,2、探針變性：放射性標記的探針為雙鏈時，于100oC加熱5分鐘變性并迅速在冰水浴中將探針驟冷。單鏈探針無須變性,3、打開預雜交袋棄去預雜交液，加入雜交液及變性的探針。排除氣泡后重新封好口,4、在與預雜交相同溫度下，保溫816小時,洗膜：是將濾膜上未與DNA雜交的及非特異性雜交的探針分子從濾膜上洗去的過程，非特異性雜交體穩定性較低，解鏈溫度較低，在一定溫度下，非特異性雜交體解鏈而被洗掉，而特異性雜交體則保留在濾膜上。雜交體的解鏈溫度主要取決于雜交體的同源性和溶液的離子強度兩個要素，同源性越高離子強度越高，雜交體的穩定性越高,洗膜的操作如下,1、雜交完畢，取出雜交袋，剪去一角，棄去所有的雜交液，取出膜并迅速浸泡于大量2SSC和0.5% SDS溶液中，室溫下不斷振蕩。注意不要使濾膜干燥,2、5分鐘后，將濾膜轉移至一盛有大量2SSC和0.1% SDS溶液的容器中，室溫振蕩15分鐘,3、將濾膜轉移至一盛有大量0.1SSC和0