1、第,10,講,蛋白質結構測定和分,析,生物信息學,Why protein structures,僅僅限于藥物研發嗎,各種蛋白質原子結構,解釋了生命的本質,細胞維持基本生命特征,適應內外環境,進化選擇了一套精巧的分子機制,細胞是生命的基本單位,細胞內幾乎每個生物學過程,均包含多個蛋白質相互作用,細胞：精巧的“生化工廠,蛋白質相互作用,細胞器,蛋白質,蛋白質組,基因,基因組,組織,器官,及以上層次,細胞,認識,蛋白質機器,及其相互作用模式,是破譯生命規律不,可或缺的重要層次,功能,OK,結構,功能,結構,傳統的做法,現代的做法,蛋白質結構測定與功能研究同步進行、甚至先行一步,并非一定在清楚功能的前

2、提下再開展三維結構研究,生物大分子三維結構研究方法,核磁共振波譜學,X,射線晶體學,低溫電鏡技術,測定生物大分子結構重要手段,具有不同結構特征的原子核間距、肽鍵二面角、肽鍵的動態特性等都具,有特征的核磁共振譜線,1,H,13,C,15,N,是核磁共振檢測的主要對象,各有不同的共振頻率,從而形成核,磁共振氫譜、碳譜和氮譜三部分,NMR,不破壞被測樣品的內部結構，是一種無損檢測方法,核磁共振譜儀的組成,Magnet,Probe,Console,Computer,1985,年,維特里希,Kurt W,thrich,等人公布了第一次利用,NMR,法,測定的溶液中蛋白質,蛋白酶抑制劑,IIA ( pro

3、teinase inhibitor IIA,的,結構,目前,科學家已經利用這一方法繪制出,15 ,20 ,的已知蛋白質的結構,它已廣泛應用于化學、食品、醫學、生物學、遺傳學等學科領域,直接,在溶液中,測定自然狀態下的大分子三維空間,結構，其分辨率已接近,0.12nm,它,只能測量分子量較小,15-25kDa,的生物分子,最大可測定,35kDa,的生物分子,NMR,測定結構的特點,Bioinformatics,Protein Crystal,SR X-ray source,hkl,xyz,Tracing ,Building,Final Structural Model,Initial Struc

4、tural Model,Structural,Refinement,Raw genomic data,F,hkl,Diffraction Data,Technical Roadmap from gene to protein by SR X-ray crystallography,Computer control Chapter 17:Unit 17.2,負染技術,低溫透射電子顯微鏡技術,Curr,Protoc,Protein Sci. 2005 Dec;Chapter,17:Unit 17.2,Physiology,21: 13-18, 2006,速凍技術,優點,將樣品保留在液相中,維持了天

5、然結構,高分辨率,揭示內部結構,不足,設備及操作要求較高,信噪比低,生物樣品為什么需要低溫,脂質體負染圖,脂質體冷凍電鏡圖,為什么需要低溫：冷凍超薄切片舉例,為什么需要低溫：冷凍負染舉例,低溫樣品制備,VITROBOT,VITRIFICATION ROBOT,Incubation of suspension on grid (holey,carbon or Quantifoils) at constant temperature,and humidity,Automated blotting,Plunge freezing in liquid cryogen (ethane,propane,I

6、nvestigation in amorphous ice,C-film,Suspension with macromolecules,Cryo-holder workstation,低溫樣品轉,移,過程,低于,170,C,Cryo-holder,workstation,低溫樣品桿,From Lake (1972), p.174,In theory,In practice,Cryo-EM,3D,Reconstruction,of Viruses,提純樣品,圖像整合,Localization and,EPU,Xplore3D,斷層圖像重構,單顆粒重構,Argos,低溫電鏡三維結構重建,速凍樣品制

7、備,樣品預掃描,負染,低溫電鏡,超微圖像采集,In electron microscope,2D images,In our program,3D map in computer,3D virus in real world,compute 3D maps from 2D images,Icosahedral Particle Image Reconstruction Scheme,Icosahedral Virus 3D Reconstruction Scheme,Digitize Micrograph,Select Images,Compute 3DR,Monitor Data Quali

8、ty,Done,Establish Refinement Criteria,Resolution Limits,Box Particles,Refine,N,N,More,Data,E,x,p,a,n,d,D,a,t,a,S,e,t,Y,Resample,Rebox,N,Pre-Process Images,Archive Data,Visualize & Interpret 3D Structure,Y,Determine Origin and,Orientation,q,f,w,x,y,R,e,f,i,n,e,m,e,n,t,Y,Refine CTF,Initial,3D Model,Au

9、to3dem,Digitize Micrograph,HPV58,VLP,低溫電鏡結構重建,Box Particles,1400,micrographs,6000 particles,Pre-Process Images,Remove blemish, Remove Gradient,Normalize means/variances, Apodize,Determine CTF parameters,Create Initial Parameter Files,HPV58,VLP,低溫電鏡結構重建,Specifying,Direction,of View,q,f,w,Orientation,

10、q,f,5,5,3,Z,X,Y,80,-15,w,asymetric,unit,of,HPV,VLP,5,parameters to describe a boxed particle,3 rotational angles,q, f,and,w,in degrees,2 translational parameters,x, y,in pixels,Determine Origin and,Orientation,q,f,w,x,y,x,y,Compute 3D map,Automation auto3dem,Goal: combine,good,HPV58 particle,images

11、to compute a 3D density,map,HPV58,VLP,低溫電鏡結構重建,Initial,3D Model,結構與功能示例,RIG-1,RIG-1,RIG-1(retinoic acid-inducible,gene 1,一種,dsRNA,解旋酶,細胞漿內識別病毒,RNA,的感受,器,receptor,，特異識別外源,5,ppp RNA,RIG-1,是,NF-kB,信號通路的重,要調控因子與抗病毒免疫反應,病毒感染引起的自身免疫有關,Structure.2010, 18:894,Downstream,Signal,Inactive,active,Mol Cell 2008, 29:169,結構與功能示例,RSV,RSV,呼吸道合胞病毒,RSV,respiratory syncytial virus,pneumonia,是在嬰兒時,期和兒童早期導致支氣管,炎和肺炎的主要原因,融合蛋白,Fusion protein,F,蛋白）介導病毒入胞的第,一步,F,蛋白與細胞膜融合前后的,空間結構不同，融合前,F,蛋,白,pre-fusion,可作為,RSV,感染預防新靶標,Pre-fusion protein,復合物的空間結構,Pre-fusion pro