實驗性糖尿病腎病大鼠模型建立的研究

糖尿病性腎衰竭（dn）是糖尿病的常見并發(fā)癥之一。由于一系列代謝障礙和血流量動力學的變化，糖尿病是由血液和酒精引起的。DN發(fā)病率有逐年上升的趨勢。糖尿病腎病發(fā)病機制目前尚不明了。為闡明DN的發(fā)病機制及篩選有效的藥物,建立較為理想的糖尿病腎病動物模型顯得尤為重要。目前國內(nèi)外所進行的糖尿病及其并發(fā)癥實驗動物研究多采用有糖尿病遺傳傾向的近交系純種動物,如KK小鼠、NDD小鼠、ob/ob小鼠、db/db小鼠、NSY小鼠、β糖尿病大鼠、Zuckerfa/fa大鼠等。但是這些動物的來源少,飼養(yǎng)條件苛刻,并且其特點是遺傳因素在發(fā)病過程中占主導地位,與臨床上的2型糖尿病發(fā)病特征不完全吻合。有研究采用高糖高脂飼料、鏈脲佐菌素、單腎切除、阿霉素等因素建立糖尿病腎病動物模型,但對各因素組合對模型建立無系統(tǒng)性比較。我們對這幾種因素對動物模型建立的作用進行了比較,為糖尿病腎病動物模型的建立提供實驗支持和理論依據(jù)。1材料和方法1.1動物和食物的實驗1.1.1實驗動物及分組取45～50d齡的成年雄性Sprague-Dawley大鼠30只,體質(zhì)量200～250g,分為5組,每組6只,由第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所實驗動物中心提供。1.1.2高糖和高脂肪普通飼料∶白糖∶豬油∶雞蛋=70∶9∶12∶9,由第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所實驗動物中心提供。1.2阿霉素注射液鏈脲佐菌素(STZ)購自Calbiochem公司;阿霉素注射液購自浙江海正藥業(yè)股份有限公司;速眠新注射液購自長春農(nóng)牧大學獸醫(yī)研究所;血糖試紙購自強生公司;尿微量白蛋白試紙購自Roche公司。1.3主要指標和實驗方法1.3.1阿霉素的給藥方法A組正常組:普通飼料喂養(yǎng);B組高糖高脂飼料組:高糖高脂飼料喂養(yǎng)。C組高糖高脂飼料+STZ組:高糖高脂飼料喂養(yǎng)6周后,腹腔注射STZ。D組高糖高脂飼料+阿霉素+STZ組:高糖高脂飼料喂養(yǎng)4周后,腹腔注射阿霉素,2周后注射STZ。E組高糖高脂飼料+單腎切除+STZ組:高糖高脂飼料喂養(yǎng)4周后,單腎切除,2周后注射STZ。單腎切除:實驗前大鼠禁食12h,速眠新注射液以1.0ml/kg腹腔注射,麻醉后消毒腹部,沿腹中線切開皮膚及肌肉,手術(shù)縫線沿腎蒂結(jié)扎左腎血管,剪掉腎臟,手術(shù)針縫合,肌注青霉素2萬單位,單籠飼養(yǎng),每日肌注青霉素2萬單位2次,連續(xù)1周。阿霉素給藥方法:實驗前大鼠禁食12h,阿霉素按4mg/kg腹腔注射,1周后再給予3.5mg/kg。鏈脲佐菌素給藥方法:實驗前大鼠禁食12h,STZ臨用前以0.1mmol/L枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液(pH4.6)配制成5%的溶液,按40mg/kg腹腔內(nèi)注射STZ。1.3.2大鼠尿微量降低大鼠造模后每2周放1次代謝籠,測體質(zhì)量、血糖及尿微量白蛋白,采集各組大鼠24h尿液,離心,用試紙測各組大鼠尿液中的尿微量白蛋白。大鼠造模后12周禁食12h,速眠新注射液以1.0ml/kg腹腔注射,心臟取血。沿腹中線切開皮膚及肌肉,取大鼠腎臟,稱重。1.4統(tǒng)計方法實驗數(shù)據(jù)以xˉ±sxˉ±s表示,采用SPSS13.0軟件,作方差分析,兩組間差異采用q檢驗。2結(jié)果2.1各組大鼠體質(zhì)量變化比較D組注射了阿霉素,8周時共死亡5只,剩余1只,不再納入統(tǒng)計。與A組比較,高糖高脂飼料喂養(yǎng)4周后大鼠體質(zhì)量顯著增加。B組單純高糖高脂飼料喂養(yǎng),體質(zhì)量明顯增加與各組比較有顯著差異。腹腔注射STZ后仍以高糖高脂飼料喂養(yǎng),大鼠體質(zhì)量降低與A組及B組比較有顯著性差異。結(jié)果見表1。各組大鼠造模前后體質(zhì)量差值,B組最高,依次為A、C、E組,B組顯著高于A、C、E組,A組顯著高于C、E組,C組與E組有顯著性差異,表明大鼠飼以高糖高脂飼料,體質(zhì)量顯著升高,注射阿霉素和STZ后體質(zhì)量顯著下降,結(jié)果見表2。2.2各組大鼠血清中c、b、a、e的相關(guān)性各組大鼠造模前后腎/體質(zhì)量,E組最高,依次為C、B、A組,A組與B、C、E組有顯著性差異,B組與C、E組有顯著性差異。結(jié)果見表2。表明E組造模前后腎代償性增生最顯著。2.3兩組患者術(shù)后stz及單腎切除合并腔注射stz后血糖的比較各組大鼠造模前血糖無顯著性差異,高糖高脂飼料喂養(yǎng)4周后,B、C、D、E組血糖升高,但無顯著性差異,腹腔注射STZ及單腎切除合并腹腔注射STZ后血糖升高顯著,16周時與A組及B組比較有顯著性差異,而A組與B組比較無顯著性差異。結(jié)果見表3,表明單純高糖高脂飼料對血糖升高的影響不顯著,而合并STZ及單腎切除對血糖有顯著升高。2.4尿微量白蛋白檢測限各組大鼠造模前尿微量白蛋白低于檢測限,A組與B組16周時尿微量白蛋白仍低于檢測限,腹腔注射STZ及單腎切除合并腹腔注射STZ后出現(xiàn)尿微量白蛋白。16周時與A組比較顯著升高,其中E組最高。結(jié)果見表4。3小劑量stz的應(yīng)用價值對于糖尿病及其并發(fā)癥的動物實驗研究,尤其是動物模型的建立方法,有手術(shù)方法建模,化學藥物如四氧嘧啶,鏈脲佐菌素(STZ)損傷胰島β細胞建模,培養(yǎng)自發(fā)性糖尿病動物等的方法。目前糖尿病腎病實驗研究的動物模型大多采用以下幾種途徑:①靜脈或腹腔注射大劑量鏈脲佐菌素(STZ)造成DM模型以后依其自然病情發(fā)展成DN模型(大約3個月)。所造成的糖尿病狀態(tài)類似于人類1型糖尿病。此類模型應(yīng)用于糖尿病并發(fā)癥研究的局限性在于大劑量STZ能夠大面積甚至完全破壞胰島β細胞,從而引起血糖急劇升高,大鼠體質(zhì)量急劇下降,但與2型糖尿病并發(fā)腎病的病理變化存在差距。②采用小劑量注射STZ配合高糖高脂飼料的方法進行建模。大量文獻報道也證實了這種建模方法的可行性,空腹血糖升高和糖耐量的異常是此類模型的特征,與臨床2型糖尿病比較符合。但這種建模出現(xiàn)腎功能變化的時間較長,有時根本不出現(xiàn)。③阿霉素及柔紅霉素腎病模型是曾被公認的微小病變模型,動物注射阿霉素后,使細胞膜和細胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化,造成膜的結(jié)構(gòu)破壞,造成腎小球濾過膜電荷屏障缺損和對大小分子濾過控制的缺陷,其病理改變與人類微小病變腎病極為相似,合并小劑量注射STZ可造成類似糖尿病腎病的病理變化。我們在研究中發(fā)現(xiàn)由于阿霉素毒性太大,動物存活率低,不能作為常規(guī)的建模方法。④為了縮短腎功能損害出現(xiàn)的時間,并且使腎臟的增生變化更加明顯,我們嘗試采用高糖高脂飼料誘導出胰島素的抵抗,切除單側(cè)腎臟合并注射小劑量STZ,單側(cè)腎臟切除后導致對側(cè)腎代償性增生,而腎增生是DN的一個獨立危險因素,若再給予小劑量STZ注射,加速DN的形成,節(jié)省造模和實驗的時間。在健康狀態(tài)下,切除單側(cè)腎臟以后,留存腎將發(fā)生代償性增生,Olivetti觀察到幼年大白鼠腎切除35d后留存腎小球體積增加7.7倍,而對照組僅增加了4.5倍,表明腎小球代償性增大,剩下的腎代償功能足以彌補切除腎臟所喪失的功能,但在病理狀態(tài)下,如在高血糖環(huán)境下,腎臟代償狀態(tài)很容易被破壞,造成失代償。在本實驗中采用了幾種方法進行對比,并從體質(zhì)量、血糖、尿微量白蛋白的漸進性變化等方面進行了觀察,結(jié)果顯示:①單用高糖高脂飼料喂養(yǎng)可以使大鼠體質(zhì)量增加,并且能升高血糖;②高糖高脂飼料加用小劑量注射鏈脲佐