分子生物實驗一、名詞解釋（5×3’）1.Plasmid:質粒，是細菌染色體外的遺傳物質，是染色體外小型雙鏈環狀的DNA，大小在1-200kb之間，質粒能自主復制，在細菌中不斷復制自身。2.Polymerasechainreaction:聚合酶鏈反應：即PCR技術，是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，是一種分子生物學技術，用于擴增特定的DNA片段，可看作生物體外的特殊DNA復制。包括高溫變性（94℃）-低溫復性（50-60℃）-中溫延伸（72℃）三個過程。3.RecombinantDNA:DNA重組：就是采用人工手段將不同來源的DNA片段進行重組，以達到改變生物基因型和獲得特定基因產物的目的的一種生物技術。簡言之，外源DNA與載體分子的連接就是DNA重組。4.Blue-whitescreening:藍白斑篩選：重組子篩選的一種方法，是根據載體的遺傳特征篩選重組子。5.Shuttleplasmidvector:穿梭質粒載體：是指一類人工構建的具有兩種不同復制起點和選擇標記，因而可以在兩種不同類群宿主中存活和復制的質粒載體。這些穿梭質粒載體不僅可以在大腸桿菌中復制擴增，也可以在相應的枯草、酵母、動物或植物細胞中擴增和表達。這樣利于對質粒的分子生物學操作和大量制備。6.Competent:感受態：細菌處于易吸收外源DNA的狀態稱感受態，其原理是細菌處于0℃Calc2的低滲溶液中，菌細胞膨脹成球形。7.multiplecloningsites:多克隆位點：MCS,是包含多個（最多20個）限制性酶切位點（restrictionsite）的一段很短的DNA序列。也稱為多位點接頭（polylinker），往往是人工合成的一段外源基因的插入部位的DNA序列。8.αComplementary:α互補：Lacz基因編碼的α肽鏈同失去了正常氨基末端的β-半乳糖苷酶突變體的互補現象為α互補。LacⅠ（半乳糖苷酶）有兩個主要的亞基，α亞基和ω亞基，前者的DNA序列很短，后者比較長。α與ω相結合就能表現出半乳糖苷酶活性。所以大部分基因工程菌株的基因組上都有ω亞基的序列，但是敲除了α亞基序列，默認只表達ω亞基，不會有半乳糖苷酶活性。但是如果轉化的質粒上有連續完整的α亞基序列，那么就會表達α亞基，產生“α互補”，表現出LacZ活性。9.Recombinant:重組子：含有重組DNA分子的轉化細胞。二、填空（15×1’）1.在大腸桿菌感受態細胞的制備實驗中，第6步加入Calc2的目的是：洗凈前一步殘留的LB液體，Calc2的目的是：保存細胞，使其處于感受態。2.質粒DNA的提取實驗的原理：堿裂解法提取質粒是根據共價閉合環狀質粒DNA與線性染色體DNA之間在拓撲學上的差異而達到分離目的。3.瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA實驗中，DNA分子的遷移速率取決于分子篩效應，即DNA分子本身的大小和構型。4.Loading-buffer的中文名稱是上樣緩沖液。5.dNTP是dATP、dGTP、dCTP、dTTP的統稱。6.酵母轉化的方法主要有三種，分別是醋酸鋰轉化法、原生質體轉化法和電轉化法（粒子轟擊轉化法），其中醋酸鋰的作用是其中的Li+可以中和DNA和細胞膜脂所帶的負電荷，同時它還可以在細胞膜上形成小的弘道，以便于DNA分子進入細胞，聚乙二醇的作用是能增加細胞膜的聚集，促進DNA分子粘附在細胞表面，增強轉化率。7.在大腸桿菌感受態細胞的制備實驗中，我們使用的大腸桿菌種名為：DH5α。8.在質粒DNA的提取實驗中，Tris飽和酚、氯仿、異戊醇三種成分的作用分別是使蛋白質變性，同時抑制了DNase的降解作用、加速有機相與液相分層、可以降低表面張力，從而減少氣泡產生并有助于分相。9.dNTP的中文名稱是三磷酸堿基脫氧核苷酸，dATP、dGTP、dCTP、dTTP的中文名稱分別是三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸。10.DNA重組的方法主要有黏端連接法和平端連接法。11.表達載體應具有的幾種元件包括：選擇標記的編碼序列，控制轉錄的啟動子，多克隆位點（MCS），控制轉錄的終止子和自主復制序列，轉錄調控序列，核糖體結合位點。四、簡答題（5×6’）1.簡述SDS電泳技術檢測蛋白質實驗步驟？①把玻璃板洗凈后用蒸餾水沖洗，晾干，準備2個干凈的小燒杯。②把玻璃板在灌膠支架上固定好。③配置12%分離膠。④按比例配好分離膠，用移液槍快速將分離膠加到玻璃板縫隙中，距短板上沿約2cm加少量蒸餾水，靜置至膠凝固30min。⑤用濾紙把上層的水吸干，按比例配濃縮液，沿邊緣連續平穩加入至離短板5mm處，迅速插入梳子，靜置到膠凝固，梳子需一次拔出，梳口處不得有氣泡，梳底需水平。⑥在內槽中加入電泳緩沖液，將內槽置于外槽內，外槽也加電泳buffer。⑦上樣：將各時間段的樣分別取10μl加到樣孔中，上樣時記清順序。⑧接通電源：80V恒溫電泳至溴酚藍注入分離膠，再用160V至溴酚藍距下邊0.5-1cm停止電泳。⑨撬開玻璃板，剝膠。注意分離膠要完整，做好標記后放至有考馬斯亮藍的培養皿中染2h后，用脫色液脫色（期間更換脫色液2-3次），直到蛋白質條帶清晰，觀察結果并拍照保存。2.酵母表達載體與一般的細菌表達載體有哪些相同點和不同點？相同點：要經過目的基因的獲取，目的DNA片段的擴增，載體與目的DNA片段的連接，連接產物的轉化和轉化后重組子的鑒定。不同點：酵母表達載體多為穿梭質粒載體，并且目的基因DNA片段與T4載體連接、轉化、鑒定后再用酶切目的DNA（5wbp）連接，再用PGBK7EKQ載體連接、轉化、篩選、鑒定；用于篩選標記基因主要有營養缺陷型互補基因和顯性基因兩大類。一般細菌表達載體的載體不是穿梭質粒載體，并且目的基因DNA片段只需一種載體即可鑒定篩選，一般用藍白斑篩選原理，比如在羧芐青霉-gal、IPTG的選擇平板上，涂布進行篩選。3.簡述質粒DNA提取實驗中，溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的作用？溶液Ⅰ：其中的葡萄糖能夠懸浮大腸桿菌、Tris-HCl緩沖液能控制溶液的pH值、EDTA螯合大腸桿菌中的金屬離子。溶液Ⅱ：其中的NaOH堿裂解大腸桿菌的細胞膜，2%SDS是沉淀劑。溶液Ⅲ：其中的乙酸鉀作用是使沉淀能力更強，冰醋酸是中和多余的氫氧化鈉。4.簡述瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的步驟？1.

將有機玻璃內槽洗凈晾干，放置于水平制膠器內，并架好樣品梳子。2.制膠：配置適宜濃度的瓊脂糖凝膠，準確稱量0.15g瓊脂糖干粉，放入洗好的錐形瓶內，加入15ml0.5×TBE（用量筒量取后，用紙蓋蓋著錐形瓶的口，）放入微波爐內加熱融化，然后冷卻片刻，加入1μl核酸染液，混勻，然后倒入架好的有機玻璃內槽中，待其凝固。3.拔梳子：室溫下20-30min后，有機玻璃的內槽的凝膠形成一層均勻的膠面，小心拔出梳子。4.將有機玻璃內槽連同凝膠拔出，放入電泳槽內，向電泳槽內加入電泳緩沖液（0.5×TBE），其量以沒過膠面1mm為宜。5.加樣：分別取20μlDNA和20μlloadingbuffer混勻，用移液槍將混勻的樣品緩緩加入點樣孔中（每樣孔7μl）。6.接通電源：紅色為正極，黑色為負極，DNA樣品由負極向正極移動，一般選擇80V電壓，電泳時間為30min。7.當溴酚藍移動到距凝膠前沿1-2cm處，停止電泳。8.電泳完畢，關上電源，取出凝膠，在染色體投射儀下，觀察結果。5.簡述聚合酶鏈反應的原理和過程？原理：類似于DNA的天然復制過程。反應體系為：DNA模板、反應緩沖液、dNTP、MgCl2、兩個合成的DNA引物、耐熱Taq聚合酶。包括高溫變性（94℃）、低溫復性（50-60℃）、中溫延伸（72℃）三個過程。1.根據模板，設計引物。2.在0.2PCR管內配置25μ反應體系：2.5mmol/LdNTP混合物2μl10×PCRbuffer2.5μl正向引物1μl反向引物1μl模板DNA0.5μlTaq聚合酶0.5μl雙蒸水17.5μl3.根據條件，設計PCR程序，進行擴增。①94℃預變性5min②94℃變性30s③55℃退火30s④72℃延伸1min⑤重復②③④30次⑥72℃總延伸5min4.瓊脂糖凝膠電泳分析PCR結果1%瓊脂糖凝膠，25μlPCR產物+3μlloadingbuffer，點6個孔。第一個孔加3μlmaker，后5個各點5μl產物。7.藍白斑篩選的原理的什么？原理:任何攜帶β-半乳糖苷酶基因（lacZ基因）的質粒載體轉化了染色體基因組中中存在這種β-半乳糖苷酶突變的大腸桿菌細胞后，便會產生有功能活性的β-半乳糖苷酶，經IPTG誘導后，在含有X-gal的培養基平板上形成藍色菌落；而當外源DNA片段插入到LacⅠ’中的多克隆位點后，就會破壞α肽鏈的閱讀框，從而不能合成與受體菌內突變的β-半乳糖苷酶互補的活性α肽，而導致不能形成有功能活性的β-半乳糖苷酶，因此含有重組質粒載體的克隆往往是白色的。8.pET系列的原核表達載體中外源基因在大腸桿菌中誘導表達的原理是什么？當有乳糖存在時，lac操縱子即可被誘導在這個操縱子系列中，真正的誘導劑并非乳糖本身，而是半乳糖，后者作為一種誘導劑分子結合阻遏蛋白使蛋白質構象發生變化，導致阻遏蛋白與0序列解離發生轉錄。異丙基硫代半乳糖（IPTG）是一種作用極強的誘導劑，不被細菌代謝而十分穩定。因此，被廣泛用作乳糖操縱子模型的誘導劑。pET原核表達載體中，T7啟動子下游有一個lac操縱子序列，重組質粒轉化帶有染色體T7RNA聚合酶基因的大腸桿菌中，在培養基系列中加入IPTG誘導T7RNA聚合酶生產，繼而質粒上的目的DNA開始轉錄。9.酵母lacZ報告基因的檢測方法有哪些？其中lacZ報告基因酶活性檢測的原理是什么？檢測方法：酶活性檢測原理：ONPG（2-硝基-β-D-吡喃半乳糖苷）為無色物質，在β-半乳糖苷酶的作用下可被水解為半乳糖和黃色的鄰-硝基苯酚（ONP），因此可以通過培養液顏色變化在410-420nm波長處測知β-半乳糖苷酶的活性。10.酵母表達載體篩選標記的類型有哪些？結合每種類型的篩選標記，簡單舉例說明酵母表達載體篩選標記是如何發揮作用的。類型有：營養缺陷型互補基因和顯性基因兩類。①互補基因：如Leu,TRP等，像leu營養缺陷型，當連接目的DNA片段的載體轉化入酵母感受態細胞時，能使載體片段上編碼leu合成基因表達，那此時轉化后的酵母表達載體感受態細胞不需要培養基中加入leu即可生長。②顯性基因編碼產物主要是顯性物質的抗性蛋白，如Cph,cat等，即載體有cph等抗性基因與目的DNA連接導入酵母感受態細胞后，能產生抗cph，即在含cph的培養基中能生長，即達到篩選的目的。五、實驗設計（2×15’）1.請設計一個實驗，純化PUC-18質粒雙酶切后的產物。①100μlPCR產物補水至200μl，加等體積的Tris飽和酚：氯仿：異戊醇，漩渦混勻，12000r/min離心5min，取上清（約120μl）②加等體積氯仿：異戊醇，漩渦混勻，12000r/min離心5min，取上清（約100μl）③加等體積無水乙醇（冰上預冷）和1/10體積3M醋酸鈉（pH5.2），充分混勻，沉淀DNA④手動短時離心3-5s，冰上沉淀30min⑤12000r/min離心10min，棄上清⑥用200μl70%乙醇洗滌沉淀1次（12000r/min），棄上清，空中干燥⑦加入20μlTE，溶解⑧電泳檢測3.如何確定一種新細菌中是否含有質粒？設計實驗，提取已知細菌中的質粒？判斷細菌中是否含有質粒的方法：①抗氨芐青霉素等抗性基因的篩選；②直接提取總的DNA，然后電泳酶帶；③用已知同種屬或近似屬含質粒或不含質粒的菌株作對照試驗提取質粒的方法：①先在3mlLB液體培養基中加入3μl羧芐青霉素（終濃度為50μg/mol），然后接入一個含PUC-18質粒的DH5α單菌落，37℃震蕩過夜培養②將過夜培養的菌液加入1.5ml至離心管中，4000r/min離心1min，吸去培養液，將所有菌體細胞收集于離心管中③加入100μl溶液Ⅰ于各菌體細胞的離心管中，漩渦震蕩將細菌沉淀懸浮，室溫放置10min④加入200μl溶液Ⅱ（新配置）輕輕混勻內容物，溶液逐漸變清后加入溶液Ⅲ（千萬不要用漩渦振蕩器，裂解時間不要超過5min）⑤加入150μl溶液Ⅲ（冰上遇冷）蓋緊管口，輕輕混勻數次，冰上放置15min，使質粒DNA復性（顛倒混勻）⑥12000r/min離心10min，將上清轉至另一1.5ml離心管中⑦向上清中加入等體積的氯仿：異戊醇，渦旋混勻，12000r/min離心5min，吸取上清液⑧向上清中加入等體積的氯仿：異戊醇，渦旋混勻，12000r/min離心5min，轉移上清液⑨向上清中加入2倍體積無水乙醇，漩渦混勻，室溫放置30min，12000r/min，離心10min，棄上清⑩用1ml70%乙醇洗滌質粒DNA沉淀1次，12000r/min離心5min，棄上清，空中干燥。?加入20μlTE緩沖液，使質粒DNA完全溶解，-20℃保存。現已知基因A編碼區序列信息，請設計一個實驗，將A基因克隆到表達載體中。4.現已知一個基因編碼區的序列信息，請設計一個實驗，將該基因克隆到表達載體中。基因克隆實驗的過程：獲得基因序列：通過RT-PCR或基因組數據庫獲得→引物設計及PCR擴增目的片段→PCR產物連接到載體上構建重組載體→重組載體轉化到大腸桿菌中進行質粒擴增或表達蛋白①設計引物以該基因cDNA為模板，對目的基因進行擴增。②回收目的基因DNA片段。③將目的DNA片段與T載體（PGEM-T）進行連接（16℃，15h）④將連接產物轉化入大腸桿菌感受態細胞涂布PAMP抗性平板。⑤對大腸桿菌轉化子進行鑒定（PCR，質粒酶切，測定）。⑥選取一個鑒定序列正確的轉化子，接入20μl含Amp的LB液體培養基中，220rm37℃液體培養，提質粒⑦用EcoRⅠ和HamHⅠ酶切步驟⑥中提取的質粒，對酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳，切下目的條帶，然后用凝膠回收試劑盒回收目的基因。⑧用HamHⅠ酶切載體EQ（37℃，6h左右）酶切后上樣loadingbuffer進行凝膠電泳切下目的載體條帶，用凝膠回收試劑盒回收酶切后的載體，記為PGBKT7EBQ。⑨連接：將步驟⑦中回收的DNA片段與PGBKT7EBQ通過T4DNA連接。⑩篩選轉化子，將連接產物轉化入大腸桿菌感受態細胞涂布含Kna的LB平板，37℃過夜。?對大腸桿菌轉化子進行鑒定，陽性轉化子可用于轉化酵母感受態細胞。三、判斷題1.SDS的中文名稱是十二烷基硫酸鉀。（×）2.PCR反應中，經歷高溫變性、中溫退火、低溫延伸三個階段。（×）3.DNA連接酶和DNA聚合酶相同點是都能連接磷酸二酯鍵。（√）4.大腸桿菌質粒DNA提取實驗中，加入溶液2后，冰上保溫30min。（×）5.制作DNA瓊脂糖凝膠時，應加入1μl核酸染液。（√）6.質粒DNA的提取實驗中，溶液1中的葡萄糖可以用水替代。（×）7.真核生物的基因組DNA可以用堿抽提。（×）8.大腸桿菌感受態細胞的制備實驗中，兩次加入Calc2的作用是一樣的。（×）9.胰RNA酶的作用是保存RNA的。（×）10.DNA變性是雙鏈氫鍵打開，而不是磷酸二酯鍵斷裂。（√）11.在質粒DNA的轉化實驗中，涂平板后，應立即將培養皿放入恒溫培養箱。（×）12.PUB-18質粒電泳為3條帶