鈣信號通路在克氏原螯蝦眼柄切除誘導卵巢成熟中的作用

甲殼動物的眼睛上有一個x-器官-冬腺（x-器官-環）的綜合體。該綜合體是甲殼動物神經內涵調節的中心，能分泌各種激素，如生長、轉化和腺體發育。但截至目前,國際上對甲殼動物切除眼柄后體內誘導性腺發育成熟的分子機制還知之甚少。2011年,Uawisetwathana等本研究借鑒上述國外最新研究結果,探討了克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)單側眼柄切除后卵巢的一系列變化情況,利用實時定量PCR技術比較分析了眼柄切除前、后卵巢組織中鈣調蛋白基因(CaM)與質膜Ca1材料和方法1.1配套養殖基地試驗用克氏原螯蝦雌蝦于2012年1月取自江蘇寶龍集團有限公司大豐養殖基地。選取體質健壯、活動力強、附肢完整的克氏原螯蝦雌蝦共40尾,體長為12.8～13.9cm,體重為31.2～39.1g。1.2方法1.2.1眼柄切除效果試驗蝦于實驗室暫養7d,待其活動和攝食都正常后采用鑷燙法切除右側眼柄。切除過程如下:將醫用中號鑷子于酒精燈上燒至發紅狀態后對準雌蝦右側眼柄進行燙傷摘除,處理時間為35s。分別于眼柄切除前(第0天)、切除后第1、7、15天隨機取10尾蝦,統計體長、體重、卵巢重量、性腺指數(Gonadosomaticindex,GSI)等指標。性腺指數=卵巢重量/體重×100%。1.2.2cda和ca基因檢測提取卵巢組織總RNA:活體解剖試驗蝦,分離卵巢組織,稱重后立即采用TRIzol采用iScriptSYBRGreenOne-StepRT-PCR試劑盒(Bio-Rad,USA),運用實時定量PCR技術對各試驗組克氏原螯蝦卵巢組織中CaM及PMCA基因表達水平進行檢測。針對克氏原螯蝦CaM基因(GenBank登錄號:FJ179169)使用的檢測引物為:5′-CAACGAAGTGGACGCTGAC-3′和5′-GGCTTCCCTGATCTCTTCCT-3′,擴增片段大小為103bp;針對克氏原螯蝦PMCA基因(GenBank登錄號:AY455931)使用的檢測引物為:5′-GCAAGTGGTGGCTGTAACTGGT-3′和5′-ATGGGCTTCAATTCTGGATATG-3′,擴增片段大小為108bp;內參基因18SrDNA使用的檢測引物為:5′-TGGTGCATGGCCGTTCTTA-3′和5′-AATTGCTGGAGATCCGTCGAC-3′。實時定量PCR的操作按照試劑盒說明書進行,反應條件均為:95℃預變性10s;95℃變性30s,60℃退火15s,共40個循環;最后72℃延伸10min。反應結束后設定閾值,利用SDS軟件V2.2版本輸出各檢測基因的C2結果與分析2.1眼柄切除前、后卵巢重量和分布特征趙維信等由表1可知,從單側眼柄切除前至切除后的第15天,克氏原螯蝦雌蝦體長和體重增長不顯著,體長由(13.5±0.4)cm增加至(14.2±0.7)cm,體重由(35.2±3.8)g增加至(40.5±6.8)g;相反,卵巢重量增加非常顯著(P<0.05),由(0.3±0.1)g增加至(1.9±0.6)g,從而使性腺指數由(0.9±0.2)%增長至(4.7±2.3)%,表明眼柄切除確實促進了雌蝦卵巢的快速發育成熟。觀察不同時間卵巢外觀特征可見:眼柄切除前卵巢呈白色至淺黃色,細線狀,卵粒少,無卵黃顆粒,處于發育Ⅱ期;眼柄切除后第1天卵巢呈淡黃色至黃色,線狀或條狀,出現卵黃顆粒,表明此時基本處于發育Ⅲ期;切除后第7天卵巢呈黃色至深褐色,棒狀,卵巢占據胸腔的1/2～3/4,卵黃顆粒大量生成,顯示此時處于發育IV期;切除后第15天卵巢呈深褐色至黑色,粗棒狀,占據整個胸腔,卵細胞圓形且飽滿,卵徑1.5mm以上,卵黃顆粒充滿整個卵細胞,表明此時卵巢已發育成熟,處于發育V期。2.2cdm患者眼柄切除前、后兩周ca、pmca基因表達水平的變化由圖1可知,克氏原螯蝦雌蝦眼柄的切除均大幅誘導了卵巢組織中CaM及PMCA基因表達水平的上調,兩者在眼柄切除后的第1天表達水平最高,分別為眼柄切除前的8.7倍和13.2倍;隨后表達水平逐漸下降,切除后第7天CaM及PMCA基因表達水平分別為切除前的5.1倍和9.2倍;切除后第15天兩者幾乎回到了眼柄切除前的表達水平,分別僅為切除前的1.1倍和1.4倍。以上結果表明,CaM與PMCA可能主要參與眼柄切除誘導克氏原螯蝦卵巢成熟的早期分子過程。3卵黃蛋白物質及代謝特征檢測結果本試驗中克氏原螯蝦雌蝦在單側眼柄切除后第15天卵巢已呈粗棒狀,顏色為深褐色至黑色,卵巢飽滿并占據整個胸腔,卵黃顆粒大且充滿整個卵細胞,核仁可見,表明此時卵巢已發育成熟。值得注意的是,雌蝦卵巢重量在眼柄切除后的第7天至第15天增長最為顯著,由(0.8±0.3)g增長至(1.9±0.6)g,表明此期間卵巢急速積累卵黃物質(主要包括蛋白質和脂類)。從卵巢發育成熟時間上來看,切除眼柄雌蝦比不切除眼柄雌蝦卵巢成熟時間提早2～3個月在克氏原螯蝦蝦苗人工繁育過程中,親蝦成活率低,產卵、孵化同步性差,育苗產量低等是目前制約克氏原螯蝦人工養殖的突出問題CaM是細胞內鈣信號傳導途徑中的主要信號轉導分子,介導調控由Ca克氏原螯蝦卵泡細胞中鈣信號通路的誘導激活推測是由體內的促性腺激素釋放激素(Go