7高效液相色譜技術（HPLC高效液相色譜（HPLC:HighPerformaneeLiquidChromatography）是化學、生物化學與分子生物學、醫藥學、農業、環保、商檢、藥檢、法檢等學科領域與專業最為重要的分離分析技術，是分析化學家、生物化學家等用以解決他們面臨的各種實際分離分析課題必不可缺少的工具。國際市場調查表明，高效液相色譜儀在分析儀器銷售市場中占有最大的份額，增長速度最快。高效液相色譜的優點是：檢測的分辨率和靈敏度高，分析速度快，重復性好，定量精度高，應用范圍廣。適用于分析高沸點、大分子、強極性、熱穩定性差的化合物。其缺點是：價格昂貴，要用各種填料柱，容量小，分析生物大分子和無機離子困難，流動相消耗大且有毒性的居多。目前的發展趨勢是向生物化學和藥物分析及制備型傾斜。7.1基本原理加樣流動相加樣流動相固定相——柱內填料，流動相——洗脫劑。HPLC是利用樣品中的溶質在固定相和流動相之間分配系數的不同， 進行連續的無數次的交換和分配而達到分離的過程。通常，按溶質（樣品）在兩相分離過程的物理化學性質可以作如下的分類：分配色譜：一一分配系數親和色譜：一一親和力吸附色譜：一一吸附力離子交換色譜：——離子交換能力凝膠色譜（體積排阻色譜）：分子大小而引起的體積排阻分配色譜又可分為：

正相色譜：固定相為極性，流動相為非極性。反相色譜：固定相為非極性，流動相為極性。用的最多，約占 60?70%。固定相（柱填料）：固定相又分為兩類，一類是使用最多的微粒硅膠，另一類是使用較少的高分子微球。后者的優點是強度大、化學惰性，使用 pH范圍大，pH=1?14,缺點是柱效較小，常用于離子交換色譜和凝膠色譜。最常使用的全孔微粒硅膠（3?10卩m）是化學鍵合相硅膠，這種固定相要占所有柱

填料的80%。它是通過化學反應把某種適當的化學官能團（例如各種有機硅烷） ，鍵合到硅膠表面上，取代了羥基（-OH）而成。它是近代高效液相色譜技術中最重要的柱填料類型。使用微粒硅膠要特別注意它的使用 pH范圍是2?7.5，若過堿（＞pH7.5），硅膠會粉碎或溶解；若過酸（VpH2）,鍵合相的化學鍵會斷裂。鍵合相使用硅膠作基質的優點是： ①硅膠的強度大；②微粒硅膠的了孔結構和表面積硅膠(硅膠(SiO2?nH2O)OH OHSi—O—Si—II重要的鍵合相是：硅烷化鍵合相，它是硅膠與有機硅烷反應的產物。最常用的鍵合相鍵型是： | |—Si—O—Si—CI RI Ri—Si—OH+X— —RR2硅膠 有機硅烷IRi—Si—O—S：—R+HXR2鍵合相X—Cl,CH3O,C2H5O等。R—烷:CR—烷:C8H17(即C8填料),C10H21,C18H37等0R1、R2—X、CH3等0最常用的“萬能柱”填料為“ C18”，簡稱“ODS”柱，即十八烷基硅烷鍵合硅膠填料（Octadecylsilyl，簡稱ODS）。這種填料在反相色譜中發揮著極為重要的作用，它可完成高效液相色譜70?80%的分析任務。由于C18（ODS）是長鏈烷基鍵合相，有較高的碳含量和更好的疏水性，對各種類型的生物大分子有更強的適應能力， 因此在生物化學分析工作中應用的最為廣泛，近年來，為適應氨基酸、小肽等生物分子的分析任務，又發展了CH、C3、C4等短鏈烷基鍵合相和大孔硅膠（ 20?40卩m）。按鍵合到基質上的官能團可分為：⑴反相柱：填料是非極性的，官能團為烷烴，例如： C18（ODS）、C8、C4等。⑵正相柱：填料是極性的，官能團為 -CN氰基、-NH2氨基等。⑶離子交換鍵合相：陽離子官能團：－SO3H磺酸基、－COOH羧基等。陰離子官能團：一R4N*季銨基、-氨基等。（由于硅膠基質的鍵合相只能在 pH=2?7.5的范圍內使用，而離子交換色譜要求有更寬的pH范圍，因此其基質現在仍主要使用聚苯乙烯和二乙烯苯。）流動相：反相色譜最常用的流動相及其沖洗強度如下：H2Ov甲醇v乙腈v乙醇v丙醇v異丙醇v四氫呋喃最常用的流動相組成是：“甲醇一出0”和“乙腈一H2O”，由于乙腈的劇毒性，通常優先考慮"甲醇一h2o”流動相。反相色譜中，溶質按其疏水性大小進行分離，極性越大疏水性越小的溶質，越不易與非極性的固定相結合，所以先被洗脫下來。流動相的pH對樣品溶質的電離狀態影響很大，進而影響其疏水性，所以在分離肽類和蛋白質等生物大分子的過程中，經常要加入修飾性的離子對物質，最常用的離子對試劑是三氟乙酸（ TFA）,使用濃度為0.1%，使流動相的pH值為2?3，這樣可以有效地抑制氨基酸上 a羧基的離介，使其疏水性增加，延長洗脫時間，提高分辨率和分離效果。完全離子化的溶質，例如強酸或強堿，其在反相鍵合相上的保留值很低，近于死時間流出，不能進行分析。根據離子對色譜的原理將一種與樣品離子電荷（ A+）相反的離子（B「），稱為對離子，加入到流動相中，使其與樣品離子結合生成弱極性的離子對，即中性締合物，從而增強了樣品的疏水性，加大了保留值，改善了分離效果。正相色譜常用的流動相及其沖洗強度的順序是：正己烷v乙醚v乙酸乙酯v異丙醇其中最常用的是正已烷，雖然其價格較貴，但80%的順、反和鄰位、對位異構體仍然要用正相色譜來進行分離。流動相的選擇原則是：①樣品易溶，且溶解度盡可能大。②化學性質穩定， 不損壞柱子。③不妨礙檢測器檢測，紫外波長處無吸收。④粘度低，流動性好。⑤易于從其中回收樣品。⑥無毒或低毒，易于操作。⑦易于制成高純度，即色譜純。⑧廢液易處理，不污染環境。

7.2基本參數1.保留值tR進樣tRto4 ⑴保留時間“tR”進樣至出峰的時間。⑵死時間“to”：不被柱子吸附的惰性物質的出峰時間。死時間“ to”的測定通常是使用不被柱子保留而又有紫外吸收的惰性物質，例如：正相色譜常用四氯化碳，反相色譜常用甲醇、尿嘧啶、 NaN02、NaN03等。⑶容量因子“k'：tR-to 卡.,溶質在固定相中的量k'= 或：k'=to 溶質在流動相中的量“k'是比“tR”還常用的保留值，它與柱子的大小及流速無關，只與溶質在固定相和流動相的分配性質、柱溫以及相空間比(即固定相和流動相之體企積比)有關。“k'又定義為在分配平衡時某溶質在兩相中絕對量之比，消除了保留值的波動因素，而平衡常數“K”是平衡時物質在兩相中的濃度比。k'值的范圍： 0.4vk'v20?30 k'=2?5為佳，過大則耗時太長。⑷保留體積：Vr=tR?Fc (Fc---流動相的流速mL/min)VR是在tR時間內流動相流過柱子的體積。調整保留時間：tR=tR-to調整保留體積：Vr'=Vr—Vr0=tR'?Fc⑸選擇性指標“a'和相對保留值“a”a'可以更直觀和方便地反映色譜峰分離的好壞：tR(2)a'= 進樣 tR(1) tR(2)tR(1)相對保留值(分離因子)：

2.t'R（2） k'（2）\o"CurrentDocument"a= = -t'2.t'R（2） k'（2）\o"CurrentDocument"a= = -t'r（i） k'（i）（a>1.1為好）柱效率：定義：理論塔板數N=二—標準偏差，曲線拐點處峰寬的一半即峰高0.607處峰寬的一半為便于測量，改用半峰寬:（每米柱Wi/2（或2X△tl/2）最常用的計算式:N=5.54N=5.54W1/2另一計算式:N=16Wb不如W1/2容易測量，因而此式用的較少。理論塔板高度： H=— L——柱長N經驗式：H=2dp （dp=10卩H=20卩N=5萬）（dp=5卩 H=10卩N=10萬）dp—柱填料的顆粒直徑柱效的測定和計算：以反相柱為例，流動相用87%（V/V）的甲醇：水，樣品用苯、聯苯、萘等，加快記錄儀的走紙速度，測出半峰寬W1/2，并由走紙速度換算為與tR相同的單位“分”或“秒”，代入公式，計算出柱效N。提高柱效的方法：①固定相填料要均一，顆粒細，裝填均勻。②流動相粘度低。③低流速。④升高柱溫。3.不對稱因子“Tf”：用于形容色譜峰拖尾和前伸的程度，多數為拖尾峰。BTf= A、B如上圖所示A通常Tf=1.2?1.3，若Tf>2則峰不合格。峰拖尾的原因是硅膠基質上的 Si-OH羥基未被全部鍵合而與溶質發生反應。改進拖尾要用封尾技術：即用小分子的含甲基的物質再次對硅膠進行鍵合， 封閉硅羥基；還可在流動相中加入帶 -NH2氨基（對羥基敏感）的物質，將殘余的羥基掩閉。分辨率:RS=2(t分辨率:RS=2(tR2-tR1)twi+tW24.分離度Ki和KaHPLC的目的和要求是：峰要盡可能窄（Wi/2小），峰的間距盡可能大（tR相差大）。⑴基線分離度Ki:Ki=tR(2)Ki=tR(2)—tR(1)W/2(2)—W/2(1)基線分離時用心。⑵峰高分離度:K3K3=1基線分離，K3更反映了實際分離心度。5.線速度：溶劑在柱中移動的速度。mm/sectoL—柱長如右圖所示，用實驗可找到最佳的線速度:即圖中的A點：u=1mm/sec此處不用流量而用線速度，是因為流量與柱徑有關，而線速度與柱徑無關。請記住不同柱內徑的最佳流量：to—死時間柱內徑流量線速度5mm1.0mL/min1mm/sec2mm0.2mL/min1mm/sec1mm50L/min1mm/sec由1mm/sec最佳線速度可計算出適合各種柱徑的最佳流量。由上表可以看出，用5mm柱，一天要用一并昂貴的乙腈，若用 1mm柱，則一個月才用一并。6.保留值方程:正相色譜： Ink'=a+blnCb+cCb反相色譜： Ink'=a+cCb離子交換色譜： Ink'=a+blnCbCb—強沖洗劑濃度對于不同溶質a、b、c系數不同反相色譜是線性方程正相色譜：Ink'4CbD點：同樣的容量因子，四氫呋喃用量少A點甲、乙二溶質分不開，A點甲、乙二溶質分不開，B點比C點沖洗劑濃度高，但k'小，省時間，所以選B點好。A點分不開，要尋找不是交叉點的D點的Cb濃度為分離條件所以，改變Cb濃度，保留值k'和選擇性a都改變了，尋找最佳的Cb濃度就是HPLC高效液相色譜技術的精髓所在。例如，通常用10%?90%的甲醇/水，梯度洗脫30min，即可找出適宜的Cb濃度。用高濃度Cb洗脫，可保證先將所有的峰都洗脫出來，不丟失組份，然后再調節 Cb濃度，找到更好的分離效果，加大各組份色譜峰的分離度。甲醇降低10%,k'可降低2?3倍。

7.反相色譜的一般規律:7.3HPLC系統構成7.3.1HPLC系統使用記錄儀器使用記錄：⑴各組件的牌號、型號、編號、購進日期、安裝日期、保單。⑵標準參考條件的標準色譜圖（流動相、流速、壓力、溫度、檢測器參數、樣品量等）：反相色譜：流動相：甲醇/水（70:30V/V）柱：C18流速：1.0mL/min檢測器：UV254nm樣品：尿嘧啶（測to）、苯酚、苯乙酮、硝基苯、苯甲醚、甲苯。⑶使用記錄：日期、工作內容、開機時間、樣品數、儀器狀態、操作者。⑷維修記錄：日期、原因、修理人、結果。 （可備專用維修記錄本）。⑸換柱：牌號、種類、尺寸、標準色譜圖。⑹換部件：日期、原因、型號、編號、標準色譜圖、操作人。個人實驗記錄⑴日期、天氣、室溫。⑵實驗目的。⑶色譜系統：廠名、型號等。⑷操作條件：流動相（配比、 pH、過濾脫氣情況）。⑸樣品：予處理方法、進樣體積。⑹分析結果：數據、資料、色譜圖。⑺現象記錄。⑻參考文獻。色譜柱記錄⑴原始記錄：啟用日期、填料種類、牌號、編號、標準色譜圖（流動相、流速、壓力、N、t0、tR、RS、Tf）。⑵使用記錄：儀器、樣品、操作人。⑶貯存記錄：潤濕溶劑、加蓋否。⑷維修記錄：日期、原因、措施（補柱頭、反沖、換板）。⑸柱壽命：N、色譜圖、操作人。7.3.2貯液器和流動相脫氣貯液器：常用干凈的無水甲醇試劑并作貯液器，并要加蓋以防灰塵落入，但并蓋與導管之間應有縫隙，若過緊會形成真空。貯液并內要放置燒結不銹鋼過濾器，即沉子，孔徑為10卩m,其作用是：①防止灰塵進入泵缸。② 作為進液導管的重物，使導管能沉在并底。脫氣：正相色譜如非水性凝膠色譜的流動相不必脫氣, 反相色譜的流動相需要脫氣。⑴He氦氣脫氣：10min可以除去80?90%溶入的氣體，但價格昂貴。⑵真空脫氣：這是最常用的方法,可用真空抽濾流動相的方法代替。⑶超聲脫氣：使用方便,但只能脫氣30%。⑷加熱回流：最徹底的脫氣方法,混合流動相不能用。- 、，I- 、、＞:注意：⑴溶劑過濾：常用0.5卩m膜過濾。HPLC級溶劑：無微粒，無紫外吸收，已用0.2m膜過濾。⑵貯液并要不定期更換,要有2?3個備用并,定期用酸、水、溶劑清洗。⑶沉子：用三個月后必須清洗或更換,若未用沉子,則必須用 0.51m膜過濾。⑷使用混合流動相時：易產生氣體,可在系統外予混合后脫氣。⑸流動相不暢的原因：管路阻塞、長了霉菌、管道空化、貯液并蓋子太緊。解決的辦法有：抬高貯液并或向并內加壓；去掉沉子；用稀硝酸洗去管道內微生物（洗前必須洗凈醇類）。7.3.3色譜柱填料：國產：天津試劑工廠：YWG—C18H37進口：Zorbax—ODS常用柱尺寸：長25cm，內徑4.6mm注意事項：加流路過濾器與保護柱（予柱）：通常用3cm短柱,內徑2mm。避免高壓沖擊：進樣伐快轉；泵起動時要由小流量開始。分離條件的選擇：pH:硅膠基質：pH2.5?7.0,聚合物填料：pH1?13。極端pH的流動相能溶解硅膠。溫度：高溫下用小顆粒填料柱會引起塌陷，柱效 N下降一半：3卩m柱，〉40C；5卩m柱，〉70C。柱的保存：通常灌注純有機溶劑保存。若用水（如凝膠柱），則加10％疊氮化鈉。凈化樣品：①不含微粒；②防止蛋白質沉淀在柱頭；③防止組分在固定相上保留過強。措施：先過濾樣品；先做予試驗（樣品加入流動相中變渾否？）；用予柱除去強保留組分。若用6MNaOH溶解的樣品進樣50?10卩L,硅膠柱就報廢。定期洗柱：甲醇、乙腈洗掉柱中強保留組分，正向或反向洗，不要流過檢測器，若無效：則換不銹鋼過濾片，并用同種填料加乙醇調成糊狀，補平柱頭，或挖去 2?3mm臟填料，重新填平（填料也可以不同種）。延長柱壽命：修補柱頭；換不銹鋼過濾片；沖洗柱；倒向用（柱效要下降40?60％）。7.3.4泵一往復式恒流柱塞泵三大問題：單向伐故障：紅寶石球與伐座密封不嚴。原因：⑴污染：氣泡、微粒。解決方法：用25mL水、甲醇、異丙醇、二氯甲烷依次沖洗。在稀硝酸中超聲15min，用HPLC水洗2?3次、甲醇洗2次。⑵磨損：對調紅寶石球，使面密封變為線密封。密封圈故障：滲漏、墊圈碎片污染系統。表現：壓力不穩、泵頭漏液。通常三個月或不定期換密封圈。拆泵頭：蘭寶石桿要縮至最短。氣泡：用脫氣后甲醇沖洗。予防措施：用高質量溶劑和水作流動相。流動相脫氣。3.每天結束時：先用水洗，再用甲醇洗。若用過緩沖液：必須先水洗 30?60min（1ml/min）,再甲醇洗30min，千萬不可先用甲醇沖洗，否則無機鹽沉淀堵了管路。及時換密封圈，加油。用10mL水、10mL甲醇洗泵頭排水孔。防止柱塞