1、蚤休皂苷對氧化損傷臍靜脈內皮細胞內鈣離子變革的影響高琳琳，李福榮，康莉，司艷紅，王浩【摘要】目的利用激光共聚焦顯微鏡研究蚤休皂苷Pa對H22誘導的臍靜脈內皮細胞EV304細胞損傷的鈣離子a2+的變革及其機制。要領體外造就EV304細胞，創立氧化損傷的細胞模子，然后分為5個實行處置懲罰組：正常比較組；氧化損傷組；高濃度蚤休皂苷1g/l組；中濃度蚤休皂苷100pg/l組；低濃度蚤休皂苷10pg/l組；應用激光共聚焦顯微鏡不雅察其細胞凋亡的形態學差異。并利用激光共聚焦顯微鏡不雅察、圖像闡發儀闡發各實行分組細胞中游離a2+的表達、激光共聚焦顯微鏡描記預處置懲罰前后a2+的動態表達。效果損傷組細胞內游離

2、a2+濃度顯著高于正常組(P0.01)，而各蚤休皂苷預處置懲罰組均使a2+熒光強度落落，明顯低于損傷組(P0.01)，并呈劑量依靠性效應。H22損傷劑量的刺激下，EV304胞漿內的游離a2+出現雙相變革：由靜息狀態一連增長到峰值，F為37.223.72，平臺期與靜息狀態熒光值的變革P為7.650.69，參加蚤休皂苷預處置懲罰10in后，再參加100l/L的H22，F和P均顯著落落(P0.01)。結論蚤休皂苷可以庇護H22造成的EV304細胞的氧化損傷，與按捺了鈣離子介導的凋亡通路有關，到達庇護內皮細胞、抗動脈粥樣硬化的目的。【關鍵詞】蚤休皂苷內皮細胞凋亡鈣離子動脈粥樣硬化Abstrat：bje

3、tiveTinvestigatetheeffetsandehanissfPariphyllinPanaliuindensityininjuryev304induedbyhydrgenperxide.ethdsEV304ellsereulturedinvitr,thexidativeinjuryasbuiltbyhydrgenperxide(H22,ellseredividedintfiveexperientalgrups:1.nral,2.xidativedaagegrup,3.highdensityPariphyllin1g/l,4.ediudensityPariphyllin100pg/l

4、and5.ldensityPariphyllin10pg/l.Lasernfalirspy(L)asusedtbservequietstateanddynaihangefthedensityfaliuin(a2+).ResultsTheLshedthatindaagedgrup,theexternala2+nentatinasthehighest,butinpretreatedgrups,itasdereasedindsedependentannerP0.01.H22eliitedantransientpeakfa2+iandthenfelltasubsequentsustainedhighe

5、rplateau.Pretreatentithpariphyllin1g/lfr10inutesignifiantlypreventedthetransientinreaseandsustainedtheinreasefa2+i.nlusinPariphyllinhasprtetiveatinagainstxidativedaagefEV304induedbyH22,itsehanisayberelatedtdereasingtheellapptsisandinhibitingaliuin-dereasedediatedsignaltransdutin.Keyrds：Pariphyllin;H

6、UVE;Apptsis;a2+;Atherslersis內皮細胞損傷是動脈粥樣硬化(Atherslersis,AS)產生的關鍵環節，如今占主導職位的“損傷-反響假說和邇來很多研究1證明內皮細胞凋亡在動脈粥樣硬化中的作用。H22可促進內皮細胞凋亡，而細胞凋亡在AS產生生長中起著緊張作用2。有報道創造含蚤休的方劑可以或許減輕高脂血癥大鼠動脈內皮細胞損傷，淘汰內皮細胞合成和開釋內皮素3。具有庇護動脈內皮細胞和按捺自動脈中膜平滑肌增殖的成果，從而具有防治動脈粥樣硬化和高血壓病的作用。但對付蚤休皂苷庇護動脈內皮細胞損傷防治動脈粥樣硬化產生的作用在國表里尚未見報道。為了進一步探究中藥蚤休對內皮細胞損傷的按

7、捺機制，本實行應用激光共聚焦顯微鏡不雅察其凋亡的形態學差異。并利用激光共聚焦顯微鏡不雅察闡發各實行分組細胞中游離a2+的表達；預處置懲罰前后細胞內a2+的動態表達，旨在進一步探究蚤休皂苷對細胞損傷庇護作用的機制及其之間的彼此干系。1質料與儀器1.1質料人臍靜脈內皮細胞株EV304購于武漢大學典范造就物收藏中央；蚤休干片購于濟南建聯藥店，蚤休皂苷Pariphyllin，Pa為暗赤色粉狀結晶，由泰山醫學院藥物化學教研室提取斷定，每0.5kg蚤休干片得到皂苷結晶27g，純度為98.79%。用RPI1640Gibi公司，美國造就液稀釋至1000，100，10pg/l，微孔濾膜過濾除菌，-20保存備用；

8、熒光探針Flu-3/A(leularPrbesIn產物，美國)溶于DS中，配成貯存液，放于-20冰箱保存；HEPES緩沖液(l/L)等試劑購于濟南聯星生物試劑公司。1.2儀器激光共聚焦顯微鏡：美國Bi-RadRadiane2100。2要領2.1細胞造就及干預將EV304細胞在37，5%2條件下造就，以含10%FBS的RPI1640造就液調解細胞密度至1105個/l，按每瓶2l接種于25l的細胞造就瓶，每48h調換造就液1次。待細胞交融率為70%80%時，無血清造就12h后使細胞同步化于G0期，然后按分組別離加藥舉行預處置懲罰24h，再參加氧化損傷藥物H22，終濃度為100l/L，作用12h。細

9、胞分組如下：正常比較組:不加任何藥物的造就基；氧化損傷組:H22終濃度為100l/L；蚤休皂苷高、中、低劑量預處置懲罰組:1g/l，100pg/l，10pg/l，調解各組細胞濃度為5105106個/l。2.2激光共聚焦顯微鏡不雅察遍地理組細胞內游離a2+熒光強度的含量將EV304制成105個/l的細胞懸液接種于35Petri細胞造就皿中，實行分組加藥同上，孵育24h后用HEPES緩沖液洗滌兩遍，參加終濃度為10l/L的Flu-3/A37負載。40in后再用HEPES緩沖液洗滌2次，立即置于激光掃描共聚焦顯微鏡下不雅察，引發波長為488n，發射波長為525n。實行中選用512線光束掃描成像，圖像

10、區分率為512512像素，網羅頻率0.20.5Hz。利用SiplePI軟件網絡a2+圖像、闡發a2+的改變。每個處置懲罰組拔取約莫30個細胞，記載均勻熒光強度，以此來權衡EV304內游離a2+的程度。2.3激光共聚焦顯微鏡不雅察遍地理組細胞內游離a2+的動態變革按以上所述負載EV304，設定激光共聚焦顯微鏡引發波長為488n，掃描方法為時間掃描，時間隔斷為每5s一個循環，一連掃描600個循環。起首不雅測靜息狀態下細胞內a2+程度，然后預先參加終濃度為1g/l的蚤休皂苷，10in后參加H22，終濃度為100l/L；動態不雅測細胞內a2+程度的變革，利用SiplePI軟件網絡a2+圖像、irsft

11、Exel2000闡發并繪制成熒光強度隨時間變革的時間-效應曲線。實行所測定染色條件和激光掃描參數在整個實行歷程中穩定，每實行組先后測定3次。2.4統計學處置懲罰實行數據以s表現。接納SPSS12.0軟件包闡發對實行數據舉行ne-ayANVA闡發及LSD兩兩比力。P0.05為差異有統計學意義。3效果3.1激光共聚焦顯微鏡不雅察遍地理組細胞內游離a2+熒光強度的含量遍地理組細胞內游離a2+熒光強度的含量造就的EV304負載Flu-3/A后，Flu-3和游離a2+結合，在488n波長的光引發下，可不雅察到熒光，其在胞漿內的漫衍較勻稱，效果表現，H22損傷引起EV304細胞內游離a2+濃度顯著高于正常

12、組(P0.01)，而各蚤休皂苷預處置懲罰組均使a2+熒光強度落落，明顯低于損傷組(P0.01)。且此效應呈濃度依靠性(P0.01)。效果見表1。表1Pa對細胞內游離a2+均勻熒光強度的影響(略)3.2激光共聚焦顯微鏡不雅察遍地理組細胞內a2+熒光強度的動態變革H22損傷劑量的刺激下，EV304胞漿內的游離a2+出現雙相變革：由靜息狀態一連增長到峰值，EV304細胞內游離a2+熒光強度值從靜息狀態時的15.561.57，敏捷升高到峰值58.776.24，峰值熒光變革F為37.223.72，之后落落至22.172.09，并維持于平臺期，平臺期與靜息狀態熒光值的變革P為7.650.69，參加蚤休皂苷

13、預處置懲罰10in后，再參加100l/L的H22，F和P的變革見圖1；與H22組差異明顯(P0.01)，見表2。表2Pa對細胞內動態a2+均勻熒光強度的影響(略)4討論蚤休,又稱七葉一枝花。其基源為百合科重樓屬的多蒔植物。藥用汗青久長,其以蚤休之名首載于?神農本草經?，?唐本草?收錄別號為重樓，具有清熱解毒、消腫止痛、涼肝定驚等成果。蚤休的藥理活性多樣，比年來國表里學者著眼于其生理活性和奇特的藥用代價，運用當代藥理要領，為中藥蚤休的一些臨床應用提供了理論根據，同時也創造白它的一些新作用4。為研究蚤休皂苷對過氧化損傷后所導致的細胞凋亡的作用機制，在實行中我們接納熒光染料Flu-3/A結合激光掃描

14、共聚焦顯微鏡技能測定細胞內a2+，其原理是Flu-3與游離a2+有特異性親和力，對游離a2+濃度變革非常敏感。其自己不克不及透過細胞膜，但與酯性基團A毗連后可導入細胞。Flu-3/A導入細胞后，在胞內非特異性酯酶水解作用下開釋出Flu-3，Flu-3通常不被細胞器分開，其與胞漿游離a2+結合后可被必然波長的光引發產生熒光，熒光強度與游離a2+濃度成正比。a2+濃度越多，熒光強度越大，因此是如今最抱負的檢測細胞內游離a2+的要領之一。激光共聚焦顯微鏡表現，蚤休皂苷干預后，深赤色的胞核明顯淘汰，晚期凋亡量淘汰；各蚤休皂苷預處置懲罰組均使a2+熒光強度落落，明顯低于損傷組，因此，誘導內皮細胞的凋亡，

15、同時長時間的鈣超載又會引起細胞的殞命，這些作用大概是H22導致內皮細胞存活率落落的緣故原由之一。H22升高可以引起內皮細胞存活率落落，誘導內皮細胞凋亡，而升高誘導的內皮細胞損傷和凋亡與H22升高細胞內游離鈣以及激活有關。外源性H22孵育引起EV304內游離a2+濃度顯著高于正常組，進一步作動態不雅察創造EV304賜與H22后所致胞內a2+升高呈雙相變革：先快速增長到峰值，此后落落維持于平臺期，平臺期a2+值介于峰值和靜息值之間。細胞內a2+是一種緊張的第2信使，機體細胞的很多生理運動均依靠于鈣的到場5。正常生理機制對細胞內游離鈣離子濃度的調控是有必然限度的,凌駕極限將導致細胞內游離鈣離子濃度升

16、高,引起細胞和線粒體鈣超載,從而觸發一系列有害的病理生理歷程,細胞內游離鈣作為緊張的信使到場多種細胞成果的調治,介導細胞對刺激的反響6。本實行不雅測到H22可引起內皮細胞a2+明顯升高,并出現出時間依靠性。鈣超載可引起線粒體成果停滯及酶的激活,促進膜磷脂酶剖析,產生脂肪酸、白三烯、溶血磷脂等,對細胞產生迫害作用。有資料表白7,細胞內游離鈣離子濃度升高可以激活核酸內切酶,使基因組DNA產生特性性落解,對細胞凋亡起緊張作用。本實行的氧化損傷后細胞內游離鈣濃度到達高程度，蚤休皂苷干預后，表現為劑量依靠性地低落了其濃度，說明白皂苷具有防范鈣離子超載的作用。由實行效果可以推測，蚤休皂苷可以通過穩定氧化損

17、傷的內皮細胞內的a2+，到達按捺細胞的凋亡作用以及庇護內皮細胞免于氧化損傷，制止動脈粥樣硬化疾病的產生。但是，蚤休皂苷通過哪種途徑按捺了H22誘導的游離鈣升高引起細胞凋亡，還應在卵白質表達的程度上作進一步的研究。【參考文獻】1reK,LibbyP.Intertiningfthrbsisandinflaatininathersle-rsisJ.urrpinHeatl,2022,14(1):55.2HutkapA,DeBerJ,vanderLs,etal.Adventitialinfiltratesassiatedithadvanedatherslertiplaques:struturalrgan

18、izatinsuggestsgeneratinflalhuraliunerespnsesJ.JPathl2001，193(2):263.3HuYZ,YangJ,ZhaGR,etal.FeruliaidinhibitsvasularsthusleellprliferatininduedbyangitensinJ.EurJPharal,2022,499(1-2):85.4湯海峰,趙月平,蔣永培.重樓屬植物研究J.中草藥,1998,29(12):839.5HerreraJA,Areval-Herrera,ShahabuddinAK,etal.aliuandnjugatedlinlEiaidreduespregnany-induedhypertensinanddereasesintraellularaliuinlyphytesJ.