1、純化水細菌、霉菌及酵母菌計數驗證方案1 概述：本本法是用于建立微生物檢查法時，根據中國藥典2005年版二部分要求，需對細菌、霉菌及酵母菌的計數方法進行驗證。故計劃于2006年9月份對細菌、霉菌及酵母菌的計數方法進行驗證。2 原理：根據不同的樣品，制備成供試液，再將規定量的供試液通過膜微過濾系統真空抽濾，將濾膜進行培養，對形成的菌落計數，或通過采用平皿法對形成的菌落計數，從而了解供試品的微生物含量。3 菌種：大腸埃希菌CMCC（B）44102金黃色葡萄球菌CMCC（B）26003枯草芽孢桿菌 CMCC（B）65301白色念珠菌CMCC（B）98001黑曲霉CMCC（B）980034 培養基：營養

2、瓊脂培養基 改良馬丁瓊脂培養基 5 試劑：pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液 0.9%無菌氯化鈉溶液 6 設備：MILLPORE 微膜過濾系統7 檢測方法：7.1菌液制備接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌新鮮培養物至營養瓊脂培養基中培養37培養18-24小時，用0.9%無菌氯化鈉溶液將培養物制備成菌懸液，用細菌比濁管比濁，其濁度與標準比濁管相當后，經梯度10倍稀釋至10-5-10-7，約為50-100CFU/ml，供活菌計數及驗證試驗用。接種白色念珠菌新鮮培養物至改良馬丁瓊脂培養基中25-28培養18-24小時，用0.9%無菌氯化鈉溶液將培養物制備成菌懸液，用細菌比濁管比濁，其濁度與

3、標準比濁管相當后，經梯度10倍稀釋至10-5-10-6，約為50-100CFU/ml，供活菌計數及驗證試驗用。接種黑曲霉孢子液至改良馬丁瓊脂培養基中，經25培養5-7天，加入3-5ml0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫，吸取孢子懸液，用細菌比濁管比濁，其濁度與標準比濁管相當后，經梯度10倍稀釋至10-4，約為50-100CFU/ml，供活菌計數及驗證試驗用。 7.2活菌計數 分別取上述大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌10-5-10-7稀釋液各1ml加入平皿，再用不超過45的營養瓊脂培養基20ml注皿，每個菌株各測定2皿，30-35培養48小時，計算菌落數。分別取上述白色念珠菌10-5-

4、10-6稀釋液、黑曲霉10-4稀釋液各1ml加入平皿，再用不超過45的琥珀紅瓊脂培養基20ml注皿，每個菌株各測定2皿，23-25培養逐日觀察計數。7.3供試液的制備取供試品10ml加入到pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液90ml中，混勻后即為1：10供試液。取上述1：10供試液，加入到pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液90ml中，混勻，作為1：100供試液。7.4回收率的測定薄膜過濾法：.試驗組：取適量無菌注射用水注入開放式濾杯中以濕潤濾膜，后取1：100供試液100ml、50-100cfu試驗菌同時加入濾杯中，抽濾，后將濾膜夾入到適宜試驗菌培養的培養基平皿中，共制備兩張濾膜，置規定溫度培養

5、規定時間，逐日觀察結果。.菌液組：取適量無菌注射用水注入開放式濾杯中以濕潤濾膜，后取滅菌pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液100ml、50-100cfu試驗菌同時加入濾杯中，抽濾，后將濾膜夾入到適宜試驗菌培養的培養基平皿中，共制備兩張濾膜，置規定溫度培養規定時間，逐日觀察結果。.供試品對照組：取適量無菌注射用水注入開放式濾杯中以濕潤濾膜，后取1：100供試液100ml加入濾杯中，抽濾，后將濾膜夾入到適宜試驗菌培養的培養基平皿中，共制備兩張濾膜，置規定溫度培養規定時間，逐日觀察結果。8 驗證內容、方法及限度：8.1 設備確認 檢查驗證所使用的設備的檢定狀，并按下列方式記錄檢查結果。設備名稱及型號產地檢定結論備注MILLPORE 微膜過濾系統美國 檢查純化水的細菌、霉菌及酵母菌計數測定的方法驗證所需文件。文件名稱存放處微生物限度（細菌、霉菌、酵母菌含量）測定標準操作細則三聯式Microfil過濾系統使用標準操作細則中華人民共和國藥典2005年版二部8.2回收率的計算按如下公式計算試驗組的加菌回收率： 試驗組的平均菌落數供試品對照組的平均菌落數試驗組的加菌回收率 ×100% 菌液組的平均菌落數8.2試驗限度經