1、羧甲司坦對慢性被動吸煙大鼠氣道細菌負荷的影響及相關機制    目的慢性阻塞性肺疾病(COPD)在病程進展中常伴有急性發作,加速肺功能的下降,增加經濟負擔和病死率。69.6%的急性發作與細菌感染有關。宿主局部炎癥反應與氣道細菌負荷量的增加成正比。2002年Miravitlles提出了COPD急性細菌感染的“閾值理論”。他認為,出現急性發作的前提是氣道內的細菌負荷必須達到某最小閾值。影響COPD急性發作細菌閾值水平的因素有內在因素(肺功能受損、重度吸煙、氣道高反應性、氣道黏液高分泌和防御機制受損)和外在因素(細菌種類、干燥低溫環境、空氣污染和穩定期和急性發作

2、期處理不當)。粘液纖毛清除功能是氣道的非特異性防御機制,可以通過粘液纖毛清除系統清除病原菌,減低氣道的細菌負荷。羧甲司坦是經典的粘痰溶解劑,最新的體外研究證實其具有抗炎抗氧化特性,它可以清除ROS；并可抑制NE引起的粘蛋白的產生和抑制鼻病毒感染；它可以減少細菌粘附率,其抗細菌粘附特性與粘蛋白相關性很強。我們前期的PEACE研究表明,中至重度COPD病人口服羧甲司坦或安慰劑一年,羧甲司坦組可有效減少急性發作的次數,但其確切的機制還不清楚。本研究在體首次探討了羧甲司坦對慢性吸煙大鼠氣道的細菌負荷的關系,并從MUC5AC粘附細菌和MCC清除細菌功能方面探討了相關機制。本研究旨在為羧甲司坦的臨床應用提

3、供實驗依據。方法1.COPD鼠模型的制備SPF級雄性Wistar大鼠96只隨機分為4組,每組24只。A組正常對照組：正常飼養12周；B組COPD組：慢性被動吸煙12周,自制被動吸煙玻璃熏箱(0.8×0.6×0.6m3),箱頂留有2×2cm2的通氣孔,燃燒大前門牌香煙,由三通管導入煙霧。一次熏煙燃燒大前門香煙12支,煙霧濃度約5%,持續0.5小時,每日吸煙2次,上下午各一次,每周5天,連續12周。C組羧甲司坦預防組：除吸煙外,從第1周起,羧甲司坦500mgkg于吸煙日熏煙前半小時灌胃；D組羧甲司坦治療組：除吸煙外,從第6周起,羧甲司坦500mgkg于吸煙日熏煙前半小

4、時灌胃。2.肺功能測定戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉,將各組大鼠應用AniRes2005動物肺功能分析系統(北京貝蘭博科技有限公司)檢測0.3秒率。3.肺組織切片和BALF液的留取肺組織放入4%多聚甲醛中固定石蠟包埋切片用于組織化學和免疫組織化學檢測。其余右肺組織置-80保存用于PCR和Wester-blot檢測。4.阿辛藍-過碘酸雪夫染色(AB-PAS)石蠟切片經常規脫蠟至水后行AB-PAS染色以評價粘液樣物質的表達和杯狀細胞增生。5.免疫組織化學染色SABC法Muc5ac免疫組化檢測用于測定Muc5ac陽染細胞數和Muc5ac表達的多少。6.實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈(RT-PCR)法檢測大鼠氣道

5、Muc5acmRNA表達。7.蛋白質印跡實驗(Western Blot):檢測大鼠氣道Muc5ac蛋白的表達。8.閃爍照相技術測定大鼠的粘液纖毛清除功能測定口咽滴入99mTc-Sc清除過程,作為評價大鼠的粘液纖毛清除功能9.大鼠肺部接種Hi后細菌負荷的測定12周后各組大鼠氣管內接種定量的流感嗜血桿菌混懸液,3h后無菌取BALF和肺,BALF液和肺組織勻漿后計數細菌菌落為細菌負荷。結果1.COPD鼠模型確立肺組織病理學檢測示B組有一定數量的炎細胞浸潤并伴有肺泡壁破裂肺泡融合,肺泡腔擴大,肺功能檢測FEV0.3/FVC<0.05。3.大鼠氣道的細菌負荷B組大鼠氣道的細菌負荷較A組升高,C組和

6、D組經羧甲司坦干預后細菌負荷降低,P<0.05。4.粘液纖毛清除功能測定較對照A組相比,B組粘液纖毛清除系統功能的下降,C組和D組粘液纖毛清除系統功能改善,P<0.05。且C組的改善作用更為明顯。結論1.被動熏煙12周復制出COPD鼠模型2.羧甲司坦降低了慢性阻塞性肺疾病大鼠氣道的細菌負荷,3.羧甲司坦改善了與細菌粘附和清除相關的氣道的粘液高分泌和粘液纖毛清除系統功能,這可能是細菌負荷降低的機制。4.羧甲司坦預防組效果更優,可能與其抗氧化作用更充分有關。羧甲司坦是粘痰溶解劑,最新的研究證實體外具有抗炎抗氧化作用,可有效清除活性氧、羥自由基和谷胱甘肽,且粘液溶解劑減少細菌粘附率,其抗

7、細菌粘附特性與粘蛋白相關性很強。我們前期的體內研究證實羧甲司坦可以減少COPD大鼠氣道的細菌負荷并減輕了粘液高分泌狀態,而吸煙可以通過氧化應激機制引起氣道的粘液高分泌,我們推測羧甲司坦可以通過抗氧化機制抑制粘液高分泌,從而減少了細菌的粘附而使氣道細菌負荷降低。本研究擬檢測羧甲司坦對吸煙誘導的粘液高分泌的效應以及與吸煙誘導粘蛋白產生相關的ROS的產生量。方法NCI-H292細胞,人類粘液表皮細胞癌細胞系,處理因素是吸煙和羧甲司坦。以EGFR和ERK特異性抑制劑AG1478和PD98059為干預條件。采用RT-PCR、ELISA和Western-blotting技術觀察培養細胞黏蛋白MUC5ACm

8、RNA、MUC5AC蛋白的表達,測定了細胞內ROS產量和以及EGFR和磷酸化EGFR和ERK的量。結果羧甲司坦減少了吸煙誘導的MUC5ACmRNA和蛋白的表達,羧甲司坦也減少了吸煙誘導的細胞內ROS的產量。羧甲司坦減少了p-EGFR和p-ERK蛋白的產生。結論羧甲司坦對吸煙誘導的NCI-H292細胞內粘蛋白的產生的抑制作用部分與ROS的產生相關。且羧甲司坦的這種效應是通過抑制p-EGFR和p-ERK而起作用的。同主題文章1.    陳秀琳,許永鵬. 高效液相色譜法測定羧甲司坦顆粒劑中羧甲司坦的含量' J. 海峽藥學. 2002.(04) 

9、;   2.    吳義杰,李云華,劉超美. 高密度羧甲司坦的制備' J. 中國醫藥工業雜志. 1998.(03)    3.    張曉松,羅萍,周琳. 羧甲司坦及其片劑的紅外光譜鑒別' J. 中國藥事. 2005.(01)    4.    長期服用羧甲司坦可防慢阻肺發作' J. 山東中醫藥大學學報. 2008.(05) 

10、0;  5.    戴敏,鐘秋,孫華,陳波,曾照宏,冒國光. 羧甲司坦泡騰片的人體相對生物利用度研究' J. 中國臨床藥理學雜志. 2001.(02)    6.    李莉,熊守軍. 羧甲司坦分散片的制備及其相關質量評價' J. 中國生化藥物雜志. 2001.(01)    7.    余瓊娥,張彬. 羧甲司坦分散片的溶出度測定' J. 廣東藥學. 2

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