1、人線粒體DNA 熒光定量 PCR檢測方法的建立作者：王學波，李建遠作者單位：青島大學醫學院附屬煙臺毓璜頂醫院中心實驗室，山東煙臺【摘要】建立SYBR Green I實時熒光PCR定量檢測人線粒體 DNA的方法。選取人線粒體DNA高度保守基因片段，將該基因片段與 PCF-T載體連接后，轉化入 E.coli DH5 a，提 取重組質粒PCR及測序鑒定后，作為陽性模板建立 SYBR-Green I熒光定量PCR標準曲 線和熔解曲線。結果表明：構建的標準曲線線性關系良好（反應體系中含101108拷貝時,擴增反應CT值與拷貝數的對數成線性關系），相關系數為0.997。批內和批間重復性測定的變異系數分別為

2、 1.23%3.29%以及3.10%5.21%。我們成功建立了實時熒光定量PCR檢測人線粒體 DNA的方法，該方法可作為進一步研究線粒體DNA的方法,斷和監測中具有一定的應用前景。在相關疾病診【關鍵詞】SYBR Green I ;熒光定量PCR ;線粒體DNA ;聚合酶鏈反應;Establishme nt of the Method for Detect ing Huma n Mitoch on drialDNA with Fluoresce nee Qua ntitative Ploymerase Chai nWANG XueboLI Jia nyuan(The Affiliated Yan

3、 tai Yuhua ngdi ng Hosp ital of Qin gdao Medical Uni versity,Yantai264000 , China )Abstract : To estiblish a SYBR-Green I fluoresce nt qua ntitative PCR method to detecthuma n mitoch on drial DNA.Huma n mitocho ndrial DNA was an alyzed and sp ecial p rimerswere desig ned and syn thesized accord ing

4、to the con served gene seque nee. The sp ecificfragme nt was cloned into p CF- T vector which was tran sformed into E.coli DH5a . Thepo sitive recomb inant p lasmid ide ntified by seque ncing was used as qua ntitative temp lateto gen erate sta ndard curve and melt curve. Results showed that the sta

5、ndard curvesuccesfully showed a lin ear relati onship betwee n cycle threshold(Ct)a nd temp lateconcen tratio n ranging from 101 to 108 copi es,a nd the correlatio n coefficie nt was0.997.The coefficie nt of variatio n values for both in tra-ex perime ntal and in ter-ex perime ntalrep roducibility r

6、anged from 1.23% to 3.29 % and 3.10% to 5.21%, resp ectively.It mea nsthat the method for detect ing huma n mitoch on drial DNA with fluoresce nee qua ntitativepoly merase cha in reacti on is deve loped successfull y.It shows good rep eatability andsen sitivity in detect ion of huma n mitoch on dria

7、l DNA. This method can facilitate thepoten tial app licati ons in the fields of laboratory diag no sis and detect ion.Key words : SYBR Green I; Fluoresce nt qunan titative PCR; Mitocho ndrial DNAPolymerase chain reaction ; Human線粒體作為真核細胞中一種重要而獨特的細胞器，其性狀和數量的改變與人的疾病密切相關。研究線粒體與疾病的關系，既有理論意義，在醫學上也有潛在的應用前

8、景。稱為細胞動力工廠的線粒體，因其生命周期有限，具有高的更新率，形態、大小、數量和分布常因細胞種類不同而異。本研究旨在建立人線粒體DNA熒光定量PCR方法，為進一步研究線粒體DNA與人的疾病的關系奠定基礎。1材料與方法1.1實驗材料人EDTA抗凝血2 ml，菌種為本室保存的大腸桿菌E.coli DH5 a1.2試劑PCF-T連接試劑盒、PCR反應試劑盒、DNA產物純化試劑盒、瓊脂糖凝膠 DNA回收試劑盒、質粒提取試劑盒等購自TIANGEN 公司；BigDye Terminator v3.1試劑盒、SYBRPCR Mastermix 購自ABI公司；人淋巴細胞分離液購自灝洋生物公司。1.3儀器B

9、IO-RAD公司iCycler熒光定量ABI公司PCR儀，HERAEUS公司高速離心機 BIOFUGEPICO ,9700 PCR擴增儀，大和公司恒溫金屬浴，BECKMAN公司紫外分光光度計DU-640，復星公司電泳儀， KODAK公司凝膠成像系統， ABI公司310測序儀。1.4目的片段引物的設計、合成比較人線粒體 DNA全序列，設計特異引物，引物由三博遠志合成，序列如下上游引物:5 -ATACCCATGACCAACCTCCTACTCCTCATT-3'下游引物:5 -CTGCTCGCAGTGCGCCGATCAGGGCGTAGT-3 '。1.5 DNA樣品的提取、擴增及回收取人

10、EDTA抗凝血2 ml，用淋巴細胞分離液分離外周血單個核細胞，分別吸取人單個核細胞(1X106/mL ) 5 ul，離心，棄上清。放入 20 ul裂解液中(Chelex reage nt), 56 C 消化1 h ,98 C 10 min, DNA 樣品-20 C保存。PCR反應體系：上下游引物各1 ul (10 umol/L )、 dNTPS 2 ul、Taq DNA 聚合酶 0.5 ul、10 XTaq Buffer 2.5 ul、DNA 樣品 2 ul、ddH20 16 ul, 輕輕混勻，短暫離心，按照下列條件進行擴增：94 C預變性5 min ; 95 C 30 s、55 C 45 s

11、、 72 C 45 S,共35個循環；72 C延伸3 min。 PCR產物于瓊脂糖凝膠上進行電泳、檢測，并 用膠回收試劑盒純化回收。1.6克隆載體的構建回收的片段與PCF T載體連接，產物轉化DH5a菌，然后利用Amp抗性進行篩選。從平板中挑出7株轉化菌，按質粒抽提試劑盒提供的方案配液、提取。對質粒進行PCR電泳鑒定，鑒定陽性的質粒用測序證實。1.7 熒光定量 PCR標準曲線制作用紫外分光光度計檢測質粒濃度人線粒體，進一步轉換成拷貝濃度，用水10倍梯度稀釋定擴增曲線和標準曲線，總反應體系為25 L內含：上下游引物(10PCR Mastermix 12.5 Z模板1卩L PCR級水8.5反應條件

12、為S, 55 C 45 s , 72 C 45 s，每循環延伸后檢測熒光，共38個循環,成 108-101 拷貝 /u1。使用 SYBR PCR Mastermix kit (ABI ) ,BIO-RAD iCycler PCR 儀測 卩 mol/L各 1 卩 L，SYBR :95 C 5 min ; 95 C 3072 °C 7 min。1.8熔解曲線的制作PCR產物的熔解曲線，95 C 2 s后以0.3 C /3 s降溫到65 C,連續檢測熒光信號，繪制 以了解樣品擴增的特異性，保障測定結果的準確可靠。2結果2.1重組質粒的鑒定和 DNA序列分析發現特異的目的條帶2，測序結果與預

13、期序列進行比將構建重組質粒用設計的引物進行擴增，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測,(405bP )，見圖1。鑒定陽性的質粒進行測序，結果見圖 對，結果序列完全相同，說明目的片段已經成功重組。2.2標準曲線和線性關系0.997。反應體系中含1X1011X108拷貝分子時，擴增反應CT值與拷貝數的對數呈線性關系， 標準曲線回歸方程為 Y=-3.320X+38.983 ，其中丫為CT值，X為質粒模板拷貝數以10為底的對數，見圖3。標準曲線顯示出相關系數為2.3標準曲線的靈敏性將線粒體DNA標準品做梯度稀釋(1 XW11X108),進行熒光定量PCR ,得到系列曲線， 至每個梯度均有特征性擴增曲線，呈明顯的“

14、S型，見圖4。說明用此引物通過熒光定量 PCR測定人線粒體DNA敏感性好。2.4特異性用抽提的線粒體 DNA作為陽性模板，結果與預期完全相符 ，無非特異性擴增。而非靶模 板的反應孔無熒光信號出現。熔解曲線只見一特異性峰，見圖5，說明此引物特異性高，表明該方法有良好的特異性。2.5重復性實驗將系列稀釋的質粒標準品，用熒光定量PCR重復測定3次,每次每個稀釋度重復 3管。結 果表明，用該方法檢測的批內和批間變異系數分別為1.23%3.29%以及3.10%5.21%，說明該方法具有較好的可重復性及再現性。3討論線粒體是真核細胞內的重要細胞器，不僅維持細胞正常生理功能，在細胞凋亡和死亡中也發揮重要作用

15、。線粒體是細胞能量生成場所，通過氧化磷酸化為有機體，提供90%的ATP能源；參與尿素循環，調節細胞內Ca2+平衡，從而參與細胞信號轉導。線粒體參與細胞凋亡功能的發現加深了對細胞凋亡機制的理解。它還產生還原性物質有利于細胞的解毒功能。可見，線粒體在生物的生長、發育、代謝、衰老、疾病、死亡以及生物進化等方面都有非常 重要的意義。近年來國內外對 mtDNA與腫瘤之間的關系有所研究，并提出了一些假說，已有的研究 資料提示腫瘤的生物學特征不僅取決于核內遺傳物質，而且與核外的線粒體DNA也有一定的關系1，可能與易受損傷而不易修復有關。線粒體DNA基因組缺乏損傷修復系統而又直接暴露于氧化磷酸化過程所產生的高

16、氧環境，是其發生損傷的重要因素。 加之線粒體基（大約的突變因組結構特點：（1）線粒體內脂肪/DNA的比值很高，使具有嗜脂性的致癌物優先在占細胞總 DNA量很少的線粒體 DNA聚集2:; （2）線粒體DNA缺乏組蛋白的保護，即是裸露的。 因此線粒體DNA是致癌物作用的重要靶點，其損傷程度和突變率顯著高于核DNA4 ：oDNA的方法。10倍于核）3。由于線粒體 DNA修復機制發育不良，效率低下，線粒體 DNA 導致線粒體功能缺陷，線粒體DNA只有過度復制產生驚人的拷貝數才能補償此缺陷】因此需要建立一個定量檢測線粒體SYBR Green I實時熒光定量PCR技術是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利

17、用熒光信號累積實時 監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。是雙鏈DNA熒光染料,通過特異性地摻入 DNA雙鏈后發出熒光，因此，PCR反應中SYBR Green I的熒光強度與 PCR產物的增加一致5-7 :。與傳統的PCR方法相比，SYBR Green I熒光定量PCR擴增具有高效性和高敏感性，可進行定量分析，且通過產物熔解分析可確 定產物的特異性。反應全程為閉管操作，檢測結果由計算機完成分析，提高了工作效率，防止了擴增產物的污染。與 Taqman探針法相比，操作簡單且成本低。本實驗中，我們通過構建人線粒體 DNA的質粒作為陽性標準品， 采用SYBR Green I

18、熒 光定量PCR方法，建立了線粒體 DNA的定量檢測方法。結果顯示，反應體系具有較高的 檢測敏感性，能檢測到低載量（10拷貝）的模板；模板濃度在 101108拷貝反應時，反 應體系具有良好的重復性和特異性。與傳統PCR相比，擴增效率高，并降低了產物可能引起的潛在污染。因此該方法的成功建立，在線粒體相關疾病的診斷、治療的監測中有一定的 應用前景。【參考文獻】1 馮作化.醫學分子生物學M .北京：人民衛生出版社，2005 : 149.J: . Mutat Res,1992,2 Shay JW, Werbin H. New evidenee for the insertion of mitochondrial DNA into the huma n geno