1、山西高原油松種群遺傳多樣性李 毳1, 2，柴寶峰1，王孟本1*1. 山西大學(xué)黃土高原研究所，山西 太原 030006；2. 山西財(cái)經(jīng)大學(xué)環(huán)境經(jīng)濟(jì)系，山西 太原 030006摘要：用酸性聚丙烯酰胺凝膠電泳（A-PAGE）技術(shù)，分析了山西高原9個(gè)油松種群在醇溶蛋白水平上的遺傳多樣性。135份材料共分離出23條帶，其中3條為共有帶，多態(tài)性高達(dá)86.95%。全部材料共出現(xiàn)53種帶型，9個(gè)不同油松種群的帶型有差異，同一種群不同個(gè)體的帶型也有所不同，說明山西高原的油松在遺傳上已產(chǎn)生一定程度分化，在醇溶蛋白水平上呈現(xiàn)出遺傳多態(tài)性。從供試材料的帶型計(jì)算出油松遺傳分化系數(shù)為0.1547，即在種群間的變異占總變異

2、的15.47%，種群內(nèi)變異為84.53%，大部分的遺傳變異存在于種群內(nèi)，但種群間的分化程度在松屬樹種中也屬于較高水平。根據(jù)23個(gè)多態(tài)位點(diǎn)計(jì)算遺傳相似系數(shù)和遺傳距離，進(jìn)行聚類分析，將山西高原9個(gè)油松種群聚為3個(gè)類群。關(guān)鍵詞：山西高原；油松；醇溶蛋白；遺傳多態(tài)性；聚類分析中圖分類號：Q948 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1672-2175（2005）05-0719-04油松Pinus tabulaeformis Carr.是我國特有樹種，主要分布于暖溫帶落葉闊葉林區(qū)，如山西、山東、河北、河南、陜西、遼寧和內(nèi)蒙古等?。▍^(qū)）的山地，是我國北方地區(qū)分布最廣的針葉樹種。山西是天然油松林分布面積最大的省份之一

3、，屬油松天然分布中心區(qū)。在山西高原天然油松林主要集中于太岳林區(qū)、關(guān)帝林區(qū)、中條林區(qū)，在太行林區(qū)、呂梁林區(qū)分布也較多。油松根系發(fā)達(dá)，適應(yīng)性強(qiáng)，耐干旱貧瘠，造林易成活，具有保持水土和保護(hù)環(huán)境的功能，是我國華北及西北荒山綠化和營造生態(tài)林的先鋒樹種。許多學(xué)者從油松的形態(tài)特征、生態(tài)特征、物候及生理、生化指標(biāo)等方面對油松的遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行過研究1, 2。但在醇溶蛋白水平上對油松種群遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究的尚未見報(bào)道。本文采用酸性聚丙稀酰胺凝膠電泳（Acidic Polyacrylamide Gel Electrophoresis, A-PAGE）技術(shù)，在醇溶蛋白水平上對山西高原9個(gè)不同油松種群的遺傳多樣性進(jìn)行分析，

4、為油松基因資源利用等提供依據(jù)。1 材料與方法1.1 材料 表1 實(shí)驗(yàn)油松種子采集地點(diǎn)Table 1 Loci of P. tabulaeformis seeds collection采集地123456789太岳龍門口中條中村呂梁上莊太行鐵橋黑茶山太岳靈空山呂梁克城蘆芽山關(guān)帝三道川經(jīng)度113°20110°59110°18113°20111°15112°17110°18111°59112°02緯度36°1535°3436°3337°2638°1236°

5、;4036°3338°4037°25本實(shí)驗(yàn)所用的9個(gè)油松種群的種子來源及編號見表1，種子在實(shí)驗(yàn)室自然風(fēng)干之后密封，置4 冰箱保存?zhèn)溆谩?.2 研究方法 樣品提取每個(gè)種群分別取15粒種子，浸種24 h，剝?nèi)∨呷?。直接放?.5 mL Eppendorf管中，按1 mg加15 mL的比例加入樣品提取液（/%，2-氯乙醇：20，2巰基乙醇：1；w/%尿素：12，甲基綠：0.05），充分研磨、混勻，室溫浸提過夜。12000 r/min離心10 min，取上清液備用。 凝膠和電泳取40 mL凝膠液（w/%, 丙烯酰胺：15.38，甲叉雙丙烯酰胺：0.62，尿素：6.0，抗壞

6、血酸：0.1，硫酸亞鐵：0.005），加入40 L w=10%過硫酸銨和40 L TEMED，搖勻，灌板，插好樣品梳，每個(gè)樣品槽加12 L樣品液，恒壓200 V，4 電泳。 染色和照相用1 g考馬斯亮藍(lán)R-250，225 mL甲醇，225 mL ddH2O，50 mL冰乙酸配制的染色液染色過夜。用甲醇50 mL，ddH2O 400 mL，冰乙酸50 mL配制的脫色液脫色至條帶清晰。用BIO IMAGINE SYSTEM (GENE GENIUS) 照相，并用BIO-RAD GelAir Dryer干膠儀制備干膠。 數(shù)據(jù)處理采用“0”“1”系統(tǒng)記錄電泳譜帶，按同一遷移率，條帶清晰的記為1，無帶或

7、弱帶記為0，構(gòu)建二元數(shù)據(jù)矩陣。應(yīng)用POPGEN 1.32（1997）軟件進(jìn)行分析。用非加權(quán)配對算術(shù)平均法(UPGMA)進(jìn)行聚類，構(gòu)建樹狀圖。2 結(jié)果與分析2.1 油松醇溶蛋白帶型分析按醇溶蛋白相對分子質(zhì)量和相對遷移率的不同，在電泳圖譜上將它們分為4個(gè)區(qū)，即I、II、III、IV區(qū)（如圖1）。由圖中可以看出，I區(qū)譜帶較細(xì)、表2 各油松種群間的遺傳相似度和遺傳距離1)Table 2 Nei's original measures of genetic identity and distance種群1234567891*0.98330.95700.98490.94720.99350.9417

8、0.95120.953320.0169*0.95740.96270.97290.98210.96920.95580.960430.04400.0436*0.94230.94180.95200.89720.97300.980340.01530.03800.0595*0.94900.97530.94820.94540.933050.05430.02750.06000.0523*0.93820.98170.97050.949160.00650.01810.04920.02500.0638*0.94430.93970.954270.06010.03120.18040.05320.01840.0574*

9、0.93270.909180.05000.04520.02730.05610.02990.06220.0700*0.958390.04780.04050.01990.06930.05220.04690.09530.0426*1) 對角線以上為遺傳相似度；對角線以下為遺傳距離染色稍淺、但很清晰，分辯率高；II區(qū)譜帶比I區(qū)稍寬、染色也較I區(qū)深，條帶清晰可辯；III區(qū)譜帶數(shù)目很多，染色最淺，分辯率相對較低；IV區(qū)條帶很寬，染色較深，但稍有托尾現(xiàn)象。條帶數(shù)目不同反映醇溶蛋白種類的多少，條帶寬窄和顏色深淺的差異反映醇溶蛋白含量和活力的不同。根據(jù)15個(gè)種群醇溶蛋白圖譜各區(qū)的條帶分布，說明不同種群間和同一種

10、群內(nèi)醇溶蛋白的種類和含量均存在一定的差異。其中III區(qū)條帶數(shù)目差異最顯著，表明不同種群醇溶蛋白種類在該區(qū)變異較豐富；I區(qū)、II區(qū)雖然條帶數(shù)目較少，但仍具有明顯的差異；IV區(qū)譜帶無論在條帶的數(shù)目、還是條帶的寬窄和顏色深淺上相差不大，一致性較高，說明油松醇溶蛋白在小相對分子質(zhì)量區(qū)變異較小。2.2 油松醇溶蛋白的遺傳多樣性圖1 太岳龍門口油松種群醇溶蛋白酸性聚丙稀酰胺凝膠電泳結(jié)果Fig. 1 Acidic PAGE analysis of prolamin from seeds of P. tabulaeformis in Longmenkou in Taiyue Mountains9個(gè)油松種群13

11、5份材料分離出23條不同遷移率的譜帶(如圖1)，其中3條帶為共有帶，其余20條均具有不同程度的多態(tài)性，多態(tài)性為86.95%，全部材料共出現(xiàn)不同帶型53種。電泳圖譜在種群間和種群內(nèi)表現(xiàn)較大的差異，油松在編碼醇溶蛋白基因水平上呈現(xiàn)出遺傳多樣性。根據(jù)135份材料的帶型計(jì)算出種內(nèi)遺傳多樣性為0.2172，種群內(nèi)遺傳多樣性為0.1836，種群間遺傳多樣性為0.0336，遺傳分化系數(shù)為0.1547，即在種群間的變異占總變異的15.47%，大部分的遺傳變（84.53%）存在于種群內(nèi)。2.3 油松種群的遺傳相似系數(shù)和聚類分析9個(gè)種群的醇溶蛋白Nei's遺傳一致度（對角線以上）和遺傳距離（對角線以下）見

12、表2。相似系數(shù)變異范圍為0.89720.9935，各種群間一致度較高。種群1和其它種群之間的相似度均很高，其中種群1與種群6幾乎完全一致，相似度高達(dá)0.9935，表明彼此親緣關(guān)系較近；種群3和種群7的遺傳相似度相對較低為0.8972，說明它們在遺傳上產(chǎn)生了相對較大的變異。根據(jù)種群間的遺傳距離，按照UPGMA法進(jìn)行聚類分析，結(jié)果如圖2所示（圖中編號同表1）。9個(gè)油松種群可聚為3個(gè)類群：山西高原東南部的太行山太岳山中條山的油松種群（種群1、種群2、種群4和種群6）為1個(gè)類群；呂梁克城黑茶山的油松種群（種群5和種群7）為1個(gè)類群；呂梁上莊關(guān)帝山蘆芽山的種群（種群3、種群8和種群9種群）為1個(gè)類群。3

13、 討論3.1 油松具有較高的遺傳多態(tài)性具有高水平遺傳變異的植物種多為壽命長，地理分布廣，風(fēng)媒異花授粉，結(jié)實(shí)量大，基因交流頻繁和處于演替末期的物種3, 10，油松是雌雄同株，典型的異花風(fēng)媒傳粉植物，具備了以上全部特征，因此十分有利于維持高水平的遺傳變異。9個(gè)油松種群135份材料分離出23條遷移率不同的譜帶，多態(tài)性達(dá)86.95 %，共出現(xiàn)53種不同的帶型，種內(nèi)遺傳多樣性為0.2172。3.2 油松種群的遺傳分化9個(gè)不同油松種群的醇溶蛋白帶型有差異，同一種群的不同個(gè)體的帶型也有所不同，說明山西高原油松在遺傳上已產(chǎn)生一定的分化。Hamrick等總結(jié)了165屬449種植物的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，自交植物的遺傳分

14、化系數(shù)Gst=0.510，即遺傳變異有一半以上發(fā)生在群體之間，而風(fēng)媒異交植物Gst=0.099，90%的變異發(fā)生在群體內(nèi)4。裸子植物的大多數(shù)類群遺傳多樣性研究結(jié)果顯示，不同物種變異水平不同。紅皮云杉Picea korainesis 種群的Gst=0.152；云南紅豆杉Taxus yunnanensis種群的Gst=0.1466；天然紅松P. koraiensis 種群的Gst=0.058；樟子松P. sylvestris L. var mongolica Litv天然群體的Gst=0.046258。李斌等對松屬19個(gè)樹種的統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，群體間的Gst平均值為0.0853，Gst最大值為0.33

15、7，Gst最小值為0.016，說明松屬不同樹種間群體分化系數(shù)差異極大9。本試驗(yàn)通過對135份油松材料的研究發(fā)現(xiàn)，油松種群遺傳分化系數(shù)Gst=0.1547，種群間的分化程度在松屬樹種中屬于較高水平。圖2 山西高原9個(gè)油松種群的聚類分析結(jié)果Fig.2 Dendrogram cluster of nine populations of P. tabulaeformis in Shanxi Plateau種群間的分化與環(huán)境因子的選擇和基因流的阻隔有關(guān)。雖然整個(gè)山西都有天然油松林的分布，但決定植物地理分布的兩個(gè)主要因素水分和熱量在各種群有差別。山西高原油松水平分布極不均勻，呈現(xiàn)出明顯的不連續(xù)性，因此種群

16、間產(chǎn)生一定分化。不同種群間的遺傳變異大小可在某種程度上說明該物種對環(huán)境的適應(yīng)能力的大小，物種遺傳多樣性越高，適應(yīng)環(huán)境的能力就越強(qiáng)。本試驗(yàn)表明油松種群遺傳分化系數(shù)在松屬樹種中屬于較高水平，說明油松對環(huán)境的適應(yīng)能力較強(qiáng)。3.3 油松種群的遺傳相似性由于某些油松種群與另一些油松種群之間在樹皮形態(tài)上存在較明顯區(qū)別，有學(xué)者將油松劃分為粗皮油松和細(xì)皮油松2。但從遺傳學(xué)角度看，9個(gè)油松種群的遺傳相似系數(shù)在0.89720.9935之間，種群間遺傳一致度較高。已有研究表明，種子植物屬內(nèi)種間的遺傳相似系數(shù)為0.67，種子植物同種的不同種群間的遺傳相似系數(shù)為0.904。本試驗(yàn)不同種群間的遺傳相似系數(shù)最低值為 0.8

17、972，接近于0.90，說明山西高原不同油松種群的親緣關(guān)系很近。3.4 醇溶蛋白在種群生態(tài)學(xué)上的應(yīng)用許多研究表明種子蛋白多態(tài)性主要是由生物的遺傳因素來決定10。醇溶蛋白是種子的貯藏蛋白，受基因組成控制，一般不受環(huán)境影響，在研究植物種群的遺傳多態(tài)性方面具有一定的可靠性。并且A-PAGE實(shí)驗(yàn)操作方便快捷，遺傳分析和數(shù)據(jù)處理方法成熟，因而得到廣泛應(yīng)用。本研究通過對不同生境下油松遺傳多樣性研究，顯示出種子醇溶蛋白是一種較好的遺傳標(biāo)記方法。參考文獻(xiàn)：1 徐化成, 等. 油松地理變異和種源選擇M. 北京: 中國林業(yè)出版社, 1991.XU H C，et al. Geographical Variation

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22、ulations of Taxus yunnanesis J. Scientia Silvae Sinicae, 2001, 37(5): 4148.7 祖元?jiǎng)? 張恒慶, 顏廷芬, 等. 天然紅松林等位酶研究J. 植物研究, 1999, 19(1): 7579.ZU Y G, ZHANG H Q, YAN T F, et al. Allozyme analysis on natural population for Pinus koraiensisJ. Bulletin of Botanical Reseach, 1999, 19(1): 7579.8 解奇明, 張敏利, 王江, 等. 樟子

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25、 Chinese pine (Pinus tabulaeformis Carr.) in Shanxi plateauLI Cui1, 2, CHAI Bao-feng1, WANG Meng-ben11. Institute of Loess Plateau, Shanxi University, Taiyuan 030006, China;2. Department of Environment Economics, Shanxi University of Finance and Economic, Taiyuan 030006, ChinaAbstract: Genetic diversity of prolamins in 135 samples of 9 populations of Chinese pine (Pinus tabulaeformis) in Shanxi Plateau was investigated by using acidic polyacrylamide gel electrophoresis (A-PAGE) technique. A total of 23