1、蛋白&抗體篇1. WB的泛抗體實驗中，為什么總是出現只有一條帶的情況？答：(1)首先要確定這條帶的大小；比如，組蛋白H3的信號會很強，經常出現在17kD左右，如果曝光時間短的話，很可能只存在信號強的條帶；(2)上樣量是否足夠；(3)抗體濃度是否正確使用；(4)熒光底物不靈敏，可調整熒光底物的孵育時間、曝光時間等。2. WB實驗中是否條帶越多，蛋白修飾的豐度越高？答：(1)客戶提到的修飾豐度指什么，是一種蛋白的修飾強弱，還是指修飾的廣譜性？(2)同一樣品，不同處理的對比，可以這么說；(3)不同樣品，不同來源，無可比性；(4)條帶的強度，可以體現該條帶大小的蛋白修飾豐度高。3. 能否用泛抗

2、體檢測單一蛋白/IP復合物的修飾信號？答：我們公司的蛋白質修飾泛抗體是指可以識別所有含該類修飾的蛋白質的抗體，與組蛋白位點特異性修飾抗體的區別在于不局限于某個蛋白的某個位點。如Lys三甲基化的修飾泛抗體可以識別所有含有Lys三甲基化的蛋白，而組蛋白H3K4Me3就只能特異性的識別組蛋白H3第4位Lys的三甲基化修飾。因此泛抗體是可以用來檢測單一蛋白/IP復合物的修飾信號。4. 抗體產品用途；如是否可以做ChIP ? IP效果如何？答：(1)抗體可以用來做 WB，ELISA，Dot，IP，IF（免疫熒光）等；(2)我們的泛抗體可以用來做肽段水平的IP且效果非常好，但不建議直接做蛋白水平的IP，效

3、果不是很好，客戶用我們的位點特異性抗體嘗試做過IP，結論是可以的；(3) ChIP：我們沒有用自己的抗體專門做過相關的檢測，但我們也準備對此進行驗證。5. 抗體可以做免疫組化么？答：免疫組化，是應用免疫學基本原理抗原抗體反應，即抗原與抗體特異性結合的原理，通過化學反應使標記抗體的顯色劑（熒光素、酶、金屬離子、同位素）顯色來確定組織細胞內抗原（多肽和蛋白質），對其進行定位、定性及定量的研究。我們的抗體是可以做免疫組化、WB、ELISA等實驗。6. 蛋白的提取，特別是枯草芽孢桿菌，發酵菌組蛋白提取的關鍵？答：組蛋白提取的方法大同小異，題目中提到的2類菌株我們暫時沒有提過。除了結核桿菌等傳染性或致病

4、菌，需要客戶經過專業處理后提供蛋白液外，其它樣本一般建議客戶直接把樣品寄來，我們負責蛋白提取。蛋白提取是整個組學項目中最前面、最基礎的一步，至關重要，好壞直接影響后續實驗結果。因此我們的技術人員經過不斷實踐總結摸索出的蛋白的提取要點也是公司的技術資源、財富。7. 我們的泛抗體做WB的比例多少，100微升可以做多少次WB？答：我們推薦稀釋比例都是1:1000，客戶可以根據實際情況自行調整。8. 用乙酰化、琥珀酰化泛抗體做WB檢測，客戶做不出條帶的原因？答：我們的乙酰化、琥珀酰化泛抗體在生產之后都有專門的質量檢測，且在所有抗體銷售中是銷量較好、客戶評價最高的兩類的抗體，質量是毋庸置疑的。建議幫助客

5、戶從自身WB檢測的實驗中找原因。9. 甲基化抗體中單甲基、二甲基、三甲基的抗體如何區分同一位點的一、二、三甲基的基團而互不交叉？答：(1) 首先，我們在抗體研發過程中，抗原多肽的合成階段已經區分開；(2) 其次，景杰生物的所有抗體都經過了嚴格QC驗證，甲基化抗體也不例外。通過Dot Blot和ELISA驗證抗體的同一位點不同修飾和相同修飾不同位點之間是否存在交叉。10. WB顯示條帶豐度較好，質譜鑒定到的蛋白種類比條帶豐度相對不好的蛋白種類要少？答：WB某一個條帶不代表一種蛋白，而是相同分子量的一類蛋白群。因此一個豐度較好的條帶里很可能既存在實際豐度高的蛋白，也存在豐度極低的蛋白，而這些豐度極

6、低的蛋白在質譜中鑒定不到是很正常的。11. WB沒有看出明顯變化，為什么還需要做修飾定量分析？答：(1) 首先要確定客戶樣品種類，比如酶類，微量變化對生物體本身都會有很大影響；(2) 同一樣品不同處理存在修飾類型變化的可能。12. 修飾性WB中經常出現低質量處沒有條帶的原因？答：(1) 進行SDS-PAGE，看低質量處的蛋白條帶豐度如何，確保蛋白的量是足夠的；(2) 膠的壓縮分離效果不好，低質量蛋白本身易彌散，且泳動速度快，易跑出分離膠。13. WB某蛋白有條帶，但是MS沒檢測到該蛋白。為什么？答：(1) WB是在蛋白水平的檢測，MS是基于肽段水平的檢測；一般來說免疫水平的檢測靈敏度是高于質譜

7、檢測的；(2) WB某條帶為分子量相近的一類蛋白，包含蛋白的豐度不同，有高有低；而質譜一般檢測不到過低豐度蛋白；(3) 某蛋白可能數據庫不全，導致MS后搜庫檢索不到；(4) 樣品制備過程中可能存在個別肽段的丟失，導致蛋白的漏檢；(5) 蛋白氨基酸序列中K或R過多或過少，導致胰酶切割形成的肽段太短或太長，而質譜有參數設置，切割肽段在7aa以下的，可信度就不高了。14. IP實驗，蛋白與抗體孵育的比例是多少？答：我們建議1:20015. 做單蛋白修飾類型鑒定及位點鑒定，蛋白所需量及純度？答：所需量：微克級；純度：既然是單蛋白，肯定要求純度盡可能地高，純度的高低直接影響到鑒定結果。16. 為什么組蛋

8、白位點特異性抗體的WB中會出現雜帶？答：通常情況下，組蛋白位點特異性抗體只會出現一個特定的陽性條帶；但在極少數情況下，位點特異性抗體所識別的構象與較大分子量的部分序列不可避免的相近時，會出現雜帶，但并不會影響檢測的結果。同時，合理提高抗體的稀釋比可以讓雜帶消失，也可以嘗試降低曝光時間或將上樣量進行調整。17. 你們公司的泛抗體指的是什么抗體？答：我們公司的蛋白質修飾泛抗體是相對于組蛋白位點特異性抗體而言的。泛抗體可以識別某一類含有某種修飾性氨基酸殘基的蛋白質。我們公司的泛抗體種類是目前業界最齊全的，不僅有常見的乙酰化、磷酸化等泛抗體，還有世界獨有的琥珀酰化、巴豆酰化、丁酰化、丙酰化、丙二酰化等

9、泛抗體。18. 以某客戶的WB protocol為例，分析WB常見操作錯誤答：(1) 提取蛋白：注意冰上操作（保持低溫環境），以及提取試劑中要加入PIC（蛋白酶抑制劑），防止蛋白提取過程中被降解；(2) 封閉：5%脫脂奶粉封閉1.5 h（用5% BSA封閉）；(3) 一抗：5%脫脂奶粉稀釋。（不能用脫脂奶粉稀釋，改用2.5% BSA）(4) 用1* PBST洗三次，每次10 min（漂洗次數可根據實際情況調整）；(5) 孵二抗5%脫脂奶粉稀釋，371 h（二抗也要用2.5% BSA稀釋，室溫即可不用37）；(6) 用1*PBST洗三次，每次10 min.(7) 顯色：將A液，B液等比例混合均勻

10、，孵育時要完全覆蓋住膜，顯色1 min（顯色時間可以根據實際情況自行調整）19. 蛋白樣品提取制備的注意事項？答：(1) 盡可能提取完全或者降低樣本復雜物，集中提取目的蛋白；(2) 保持蛋白處于溶解狀態；(3) 提取過程中防止蛋白降解、聚集、沉淀、修飾（低溫操作，加入適量的蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑）；(4) 盡量去除核酸、多糖、脂類等；(5) 蛋白樣品低溫保存，可-80長期保存，但避免反復凍融。20. WB常見問題分析1. 背景高 解決方法(1) 膜沒有完全濕透 使用100% 甲醇浸泡膜；(2) 洗膜不充分 增加洗液體積和洗滌次數；(3) 阻斷不充分 增加封閉時間，或者提高溫度；選擇合適的封

11、閉試劑；(4) 二抗濃度過高 降低二抗濃度；(5) 檢測過程中膜干燥 保證充分的反應液，避免出現干膜的現象；(6) 曝光過度 縮短曝光時間；(7) 抗體與阻斷蛋白有交叉反 檢測抗體與阻斷蛋白的交叉反應性，選擇無交叉反應 的封閉試劑；洗滌液中加入Tween-20可減少交叉反應；2 無陽性條帶 解決方法(1) 抗體染色不充分 增加抗體濃度，延長孵育時間；(2) 酶失活 直接將酶和底物混合，如果不顯色說明酶失活；選擇有效期內有活性的酶聯物；(3) 標本中不含靶蛋白或靶蛋白含量低 設置陽性對照，若對照有結果但標本沒有說明標本中不含靶蛋白或含量太低，可考慮增加上樣量；(4)試劑不匹配 一抗與組織種屬性。

12、一抗與二抗或者底物與酶系統之間不匹配，可通過設置內參照驗證二級檢測系統的有效性；(5)一抗失效 選擇有效期內的抗體；并選擇現用現配的工作液(6)HRP抑制劑 所用溶液和容器中避免含有疊氮化鈉3. 陽性條帶較弱 解決方法(1)抗體染色不充分 增加抗體濃度，延長孵育時間；(2)酶活性降低 直接將酶和底物混合，如果不顯色說明酶失活選擇有效期內、有活性的酶聯物；(3)標本中靶蛋白含量太低 增加標本上樣量；(4)洗膜過度 縮短洗滌時間；(5) HRP抑制劑 所用溶液和容器中避免含疊氮化鈉；(6)抗體活性降低 選擇在有效期內的抗體，工作液現配現用，避免長時間放置；(7)蛋白轉移不充分 充分轉膜；注意轉膜時

13、不要將正負極放反； 注意蛋白分子量大小與轉膜時間的關系（分子量較小的蛋白要縮短轉膜時間，同時選擇小孔徑的膠；而分子量很大的蛋白則要延長轉膜時間同時選用大孔徑的膠）；(8)封閉過度 減少封閉劑的量或縮短時間；換用不同封閉劑；(9)曝光時間多短 延長曝光時間；4. 條帶大小不對或有非特異性條帶 解決方法(1)二抗的非特異性 增加對照：不加一抗，其他操作過程不變，即可驗證背景是否由二抗系統來源。選擇其他二抗（特異性更強的，只針對重鏈的）；(2)一抗特異性不夠 使用單克隆或者親和純化的抗體，保證抗體的特異性；(3)蛋白降解 使用新鮮制備的標本，并使用蛋白酶抑制劑；(4)二聚體或多聚體存在 增加蛋白質變

14、性過程及強度；(5)抗體濃度過高 降低抗體（一抗、二抗）濃度；(6)蛋白上樣量過大 降低上樣量；5. 背景有斑點 解決方法(1) 封閉劑中有聚集體 使用前過濾封閉試劑；(2) HRP偶聯二抗中有聚集體 過濾二抗試劑，去除聚集體；6. 膜上出現反像（暗背景上白色帶） 解決方法(1) HRP含量過高 降低酶聯二抗的濃度21. 我們公司的抗體優勢在那里？答：(1) 我們公司有世界上最多種類的蛋白質修飾泛抗體和覆蓋位點最全的組蛋白修飾的位點特異性抗體；(2) 公司在國內，也就是貨期短，而且可以很方便的與客戶交流，及時反饋問題；(3) 有很多文章支持，就乙酰化而言，我們發現了真核生物和原核生物中最大的乙

15、酰化組，所用抗體就是我們的抗體；(4) 最核心的一點，我們開發的所有抗體都進行了最嚴格、最全面的交叉檢驗，確保了不同修飾類型抗體間的高特異性和高靈敏度。注：別的公司抗體沒有這方面的檢驗。21. 抗體生產的流程？答：(1) 單抗：多肽合成交聯KLH為免疫原（抗原）免疫小鼠（取血檢測WB、Dot、Elisa）取脾臟磨碎與骨髓瘤細胞融合（在PEG作用下融合）選擇培養（HAT培養基）為融合的細胞死亡，雜交瘤細胞存活陽性克隆的篩選及克隆化克隆擴增及大量制備McAb（打腹水Protein G純化（一步）QC檢測(2) 多抗：多肽合成交聯KLH為免疫原（抗原）免疫兔子（取血檢測Dot,WB泛抗體時不用）檢測

16、合格（大規模取血，每次取30ml，大約要150ml）純化QC檢測上市入庫注：合成多肽一般15個氨基酸，抗原決定簇是3-5個氨基酸。種族的差異性越強越易產生抗體，但修飾位點固定，我們的抗體很難做，導致修飾的抗體貴。技術篇1. 膠條蛋白混合物鑒定時提供樣品的注意事項？答：(1) 切取的膠條應為剛脫離濃縮膠剛剛進入分離膠的樣品；(2) 跑膠的整個過程應保持干凈，防止其他蛋白質的污染；(3) 若是全蛋白的鑒定，若是全蛋白的鑒定需要增加膠條的長度，待所有蛋白都分離后，將膠條分批切下。2. 蛋白修飾類型鑒定的樣本要求？答：(1) 樣本要求更加嚴格，樣品量要足夠，否則鑒定不出全部的修飾類型及位點；可用考馬斯

17、亮藍染色，能夠看到清晰的條帶方可；(2) 樣品純度要求在90%以上。3. iTRAQ常規蛋白質組學中，如果有3個以上樣品相互比較，而且做生物重復，那需要做3個3標的實驗。這3次實驗中出現的差異怎么處理？最后得到的結論是怎么定下來的？答：因為一個iTRAQ試劑盒一次最多8標，所以，原則上3個3標，不可能同時標記完。所以樣本之間相互比較和生物重復不能兼得。如果分成3次實驗，那這三次出現的差異是沒有意義的。4. 如何做細胞器的定量修飾組學？答：我們目前相關實驗室的條件尚不成熟，很多相關的設備儀器，如差速離心機、細胞器提取試劑盒等都還沒有，暫時還不可以做關于細胞器為實驗材料的組學實驗。5. 蛋白質組學

18、中常見樣本處理方法？答：植物、動物、真菌液氮研磨 蛋白酶抑制劑細菌、可培養的細胞8mol/L Urea BufferDTT：還原二硫鍵 EDTA：金屬酶抑制劑 超聲破碎 離心、取上清 樣品蛋白提取 蛋白定量與質檢 iTRAQ標記 修飾組學項目 還原烷基化 沉淀蛋白 沉淀蛋白 酶解 酶解 還原烷基化 除鹽與標記 IP HPLC分離 除鹽 LC-MS/MS6. iTRAQ、SLIAC技術的優勢？答：iTRAQ技術：(1) 可同時對多達8個樣本進行定量分析，降低反復實驗引入的誤差；(2) 8個樣品之間可進行任意兩兩比較，增加實驗設計靈活性；(3) 為體外標記，可標記各種動物組織、植物組織、微生物、體

19、液、細胞等樣本；(4) 重復性好，靈敏度高，蛋白覆蓋范圍廣，可在單張譜圖中同時進行定性與定量；(5) 標記完全，標記效率高達97%以上，等質量的同位素標簽不增加樣品的復雜程度； SLIAC技術：(1) 多個樣品混合后同時進行分離、酶切和鑒定；后續實驗對樣品的影響是一致的，減少了實驗操作和儀器設備引入的實驗誤差； (2) 體內標記技術，標記效率高達99%； (3) 應用廣泛，可對多種在DMEM/DMEM-F12/1640三種培養基中培養的細胞進行標記；(4) 體內標記，標記效率不受裂解液成分影響，標記效果穩定。7. 修飾定量組學需要做生物學重復么？答：嚴格的來說，任何實驗為確保結果的準確性都需要

20、生物學重復。但是修飾定量組學本身費用較高，客戶一般也不會做重復；當客戶樣本數量較多時，可考慮將多個樣本混合。8. 數據分析包括哪些內容？如何看？答：分析主要包括GO分析（biological process, cellular compartment, molecular function）、Protein domain分析、Cellular pathway分析與Protein complex 分析。具體分類見“生物信息學分析內容分類”表，里面有詳細的標注。9 如何做iTRAQ修飾定量，我需要提供組織有多大？細胞要多少個呢？答：首先，做修飾定量，本身要求蛋白量要比普通組學要高，建議客戶提供盡可

21、能多的樣品。其次，不同的組織，蛋白豐度不同，不能一概而論，下面提供的為最低值供參考。(1)動物組織：不低于100mg(2)植物組織：保證研磨后不低于1g(3)細胞：一般細胞修飾定量最好用SILAC，選擇用iTRAQ做的多是一些不可傳代的原代細胞，無法SILAC標記，因此提供的是細胞沉淀，要求細胞數5*107-1*108。10. 組織內包括血管、血液等雜質細胞，如何保證數據結果不受這些雜質細胞的影響呢？答：動物組織樣本中的內部血管是無法完全除去的，但我們可以通過用PBS等緩沖液清洗處理，去掉溶血的部分等雜質，盡可能地除去雜質細胞，無法除去的內部血管等對結果的影響可以忽略不計。11. 血液可以做修

22、飾定量組學嗎？答：血液的組學一般分為三大類：(1) 全血；(2) 血細胞：紅細胞、白細胞、淋巴細胞（含B細胞、T細胞等）等；(3) 血清12. HPLC是按照什么來分組的？答：我們用的HPLC，是通過一個固相材料為C18的反相柱，根據蛋白或肽段疏水性來分離的。疏水性越小的越早洗脫下來，疏水性越大的后洗脫下來。如果說這是一個明的分組，那么在質譜進樣前，通過LC-MS還會有一個看不到的分組，原理是一樣的。13. 單一蛋白的修飾是否可以做定量？答：我們目前做的定量都是基于標記、對比的，也就是基于組學水平的。單一蛋白非要做定量的話，應該是所謂的非標定量，我們暫時不涉及。14. 單一蛋白修飾鑒定的技術策

23、略是什么？答：膠內酶解后質譜分析。15. 樣本做組學，但沒數據庫（植物）怎么辦？答：只能用來源最接近的種屬數據庫來搜庫，但提供的實驗結果僅供參考。16. 常見的修飾分別對應多少質量位移答：17. 看到你們公司網站上，乙酰化抗體偶聯樹脂有普通和優質2種，而且價格差別很大，請問是為什么？規格是多少？我如果做IP的話，一次需要用多少？答：優質的乙酰化抗體偶聯樹脂是同時偶聯了來自不同克隆株的乙酰化的單抗和多抗，抗體識別范圍擴大，從而增加了樹脂的捕捉抗體能力。而普通樹脂只用了乙酰化的單抗。我們的樹脂規格是0.25ml的干樹脂溶在含有50%甘油的slurry里，總體積是0.5ml, 偶聯的抗體可高達1 m

24、g（4mg/ml），相當于10支標準包裝的乙酰化泛抗體（2880 元/支。100微升），所以說優質樹脂售價14380元是性價比很高的。每個樹脂可以做15次IP, 一次只需用15微升左右，可以用于1-2mg的肽段溶液樣品。18. 用你們公司的抗體偶聯樹脂，進行蛋白富集，然后進行WB鑒定或質譜鑒定可以么？答：(1) 首先，我們的抗體偶聯樹脂適用于修飾性肽段的富集，也可以用于直接的蛋白富集，但效果不佳，我們也不建議這么做。原因蛋白是大分子，直接用抗體偶聯樹脂來富集很困難，修飾性的抗體及偶聯樹脂都是識別被修飾的肽段殘基，對于整個蛋白而言，修飾性位點可能在蛋白表面，也可能被蛋白三維結構包裹在內部，這樣抗

25、體及其樹脂是很難識別到的。而蛋白經酶解后的肽段，修飾位點可以完全暴露在外面，肽段分子量很小，非常利于富集。(2) 其次，您如果是想鑒定目的蛋白某種修飾的有無，我們建議您直接用我們的修飾泛抗體進行WB鑒定，或者將蛋白進行SDS-PAGE，膠內酶解后鑒定。19. 你們的平臺所用儀器是什么？答：我們有Thermo Scientific的Orbitrap Elite，QE等先進質譜儀器，都是目前市面上性能最好的。加上高水平的技術團隊和生物信息學分析隊伍，我們的平臺絕對值得您的信賴。20. 做單一蛋白或混合物鑒定的流程是什么？對樣品有什么要求？怎么收費？答：(1) 流程：分離純化酶解HPLC質譜分析(2

26、) 樣品要求：要求蛋白樣品經SDS-PAGE鑒定，考染清晰；割膠時需注意無菌操作；寄送樣品時冰袋（低溫）環境。(3) 收費：根據樣品不同，1500-2000元/膠條。21. 翻譯后修飾定量的流程是什么？可以保證通量么？項目周期多長？價格上有無優惠？答：1. 根據樣品的不同，我們一般采用2中不同的方法：(1) iTRAQ方法：可以同時在體外對8種不同蛋白質樣品加上同位素標簽，然后等量混合樣品，酶解后進行質譜分析。流程：蛋白質混合酶解iTRAQ標記HPLC質譜分析。(2) SILAC方法：細胞在穩定同位素標記的培養基中培養，細胞經6代傳代后，細胞的所有蛋白質被輕、重穩定同位素標記。等量混合標記穩定

27、同位素的蛋白質，酶解后進行質譜分析。流程：細胞SLIAC標記培養提蛋白混合酶解HPLC質譜分析。2. 物種不同，生理病理條件不同，同種修飾均有可能不同，因此很難預測修飾組學鑒定的通量，尤其對WB檢測表明修飾的底豐度和新修飾種類而言。但是，對一些常見的修飾類型，如乙酰化修飾，就哺乳類細胞樣品和組織而言，在樣品合格的前提下，我們可以保證有1000個Kac位點的鑒定。而且我們的技術水準是有保證的，我們的許多客戶在影響因子很不錯的期刊雜志上發了文章。3. 對定量蛋白質組學而言，體外iTRAQ標記需要20個工作日；體內SILAC標記需要30個工作日。另外，質譜和抗體富集也都需要大約一周的時間。因此蛋白質

28、組學項目在4050個工作日內，蛋白質修飾組學項目在6070個工作日內完成。4. 關于項目報價，我會請負責您所在區域的技術服務銷售工程師盡快和您聯系，他會根據樣品和實驗設計，在他權限范圍內，給出您最優惠的價格及詳細的報價單。22. 一對細胞做蛋白質組學，用SLIAC做需要4W，而用iTRAQ做只需2*9400元，那我為什么不選擇iTRAQ方法？答：可以從兩者的技術優勢區別來分析，SLIAC是體內標記，標記效率不受裂解液成分影響，標記效果穩定，且多個樣品混合后同時進行分離、酶切和鑒定，可以后續實驗對樣品的影響是一致的，減少了實驗操作和儀器設備引入的實驗誤差，但它最大的劣勢在于只能用于細胞樣本。而i

29、TRAQ最大的優勢在于體外標記，標記范圍可標記各種動物組織、植物組織、微生物、體液、細胞等樣本。對于可以傳代培養，用SLIAC標記的細胞樣品，肯定優先選擇SILAC，而對于一些不可傳代的原代細胞，無法SILAC標記，只能提供細胞沉淀，用iTRAQ。23. 比較iTRAQ和SILAC技術答：1. SILAC定量主要是在一級質譜，iTRAQ主要是在二級質譜定量；2. SILAC是體內標記，需要在進行材料培養的時候就加入標記，主要使用在動物或植物細胞培養的過程中，針對其他類型的組織等樣品不適用，但是iTRAQ是體外標記，是將蛋白質提取后再進行標記，可以適用幾乎所有材料樣品；3. 兩者的定量準確性及蛋白分辨率方面差