1、古DNA提取技術的概述和實踐經驗關鍵詞：古DNA; 提取技術; 污染防控;Abstract：There are many methods to extract ancient DNA from ancient raw materials. Generally, the research of ancient DNA is subject to factors such as serious degradation, while the low content of endogenous ancient DNA, the high content of microbial and modern

2、human DNA. Whether we can successfully obtain reliable and sufficient endogenous ancient DNA has always been a practical difficulty and challenge in the field of ancient DNA research. The most direct and convenient strategy to eliminate the pollution effectively is in the procedure of ancient DNA ex

3、traction. This paper summarized the common methods of ancient DNA extraction to remove exogenous pollutants. We compared and analyzed the advantages and disadvantages of each method. This paper also introduced the time commonly used in the bone lysis step and suggested the best incubation time was 4

4、 days at room temperature by exploring the effect of different lysis time on the recovery efficiency of ancient DNA. At the same time, we surveyed the representative methods of ancient DNA purification and the performance in the application. Our summary and experience could provide reference informa

5、tion for researchers in the field of ancient DNA research.Keyword：Ancient DNA; Extraction technology; Pollution prevention and control;1 、引言古DNA是指古代生物遺體或遺跡中殘存的DNA片段，包括古代人類DNA、古代動植物、微生物DNA1,2,3,4。古DNA研究為構建和復原古代人群遺傳結構和種族屬性1,2,3,4,5,6,7、群體間的交流及遷移模式8,9，以及滅絕物種的系統發育學等研究打開了通道10,11,12。古DNA的研究同時暗示我們，從原始時期以來，

6、人類的遷徙和族群間的同化一直伴隨著沖突、戰爭和疾病，近些年來古DNA的研究領域開始滲透于傳染病和瘟疫歷史等領域的研究13。當前，在抗擊新冠肺炎疫情的戰斗中，復旦大學的古DNA研究團隊成功的將古DNA研究技術和經驗應用于新冠病毒的診斷，并致力于構建新冠病毒基因序列檔案庫，有利于加深對新冠病毒的認識，防范潛在的各類風險14。得益于考古基因組學這一新興學科的出現，我們才可以利用古老的DNA重現人類祖先的歷史，通過這種方式，我們獲得了全新的視角，對人類認識過去、把握現在和選擇將來都會產生重大影響。古DNA的保存狀況不僅僅取決于樣本材料的年代，更重要的是受遺址所處環境的影響15,16。目前認為古DNA的

7、保存機制可能與牙齒和骨骼中的主要成分羥基磷灰石和膠原質相互作用有關15,17,18。古DNA與羥基磷灰石相互作用的機制是通過帶正電的鈣離子與DNA分子中帶負電的磷酸基團之間相互吸附產生的。羥基磷灰石結合的DNA與游離的DNA相比，降低了脫嘌呤的作用19和DNA被核酸酶降解20的風險。目前，DNA與膠原質的相互作用及其在古代組織中長期保存的機制還不清楚，但有人推測，在體內水溶液中自發形成的DNA-膠原質復合物可能對古DNA起到保護作用17,21。雖然古DNA研究技術逐步走向成熟，但是古DNA的污染問題一直面臨著巨大考驗。遺骸中的骨和牙基質中不僅有內源性DNA（即死亡前或死亡時存在于生物體內的DN

8、A），而且還有外源DNA，例如微生物在分解過程中進入骨或牙基質中的DNA。除了少數的例外22,23,24，微生物DNA通常占古DNA提取液的95%以上，影響了高通量測序技術的經濟高效性。雖然通過對部分DNA片段25,26,27或者全基因組雜交捕獲的方法28可以緩解外源DNA污染帶來的影響，提高古DNA測序效率，但是這一策略耗時耗力，并容易導致基因組單核苷酸突變（SNP）對比和識別的偏向性29,30。然而，更復雜的是古人類遺骸或古DNA通常被現代人類DNA污染，在這種情況下利用古DNA中的尿嘧啶（U），從現代DNA污染中把內源性古DNA分離出來。尿嘧啶（U）是由胞嘧啶（C）脫氨作用誘導并隨時間積

9、累的，優先在DNA分子31末端的單鏈懸鏈中積累。DNA聚合酶將尿嘧啶解讀為胸腺嘧啶（T），從而與參考基因組產生C到T的差異，并使古老的DNA分子得以鑒定。攜帶尿嘧啶的DNA分子也可以在文庫制備過程中被物理分離32。然而，這兩種方法丟棄了大多數不含去氨胞嘧啶殘基的古DNA片段，導致內源性古DNA大量丟失。控制污染最直接的辦法就是在古DNA提取階段，對古代遺骸中微生物和現代人類DNA進行去除。然而，大多數DNA提取方法都是針對含有完整細胞和高分子量DNA的新鮮組織而設計的。古代遺骸中的DNA，通常沒有細胞結構，而且由于沒有特征性的化學修飾，DNA甚至可能難以溶于水溶液中33。古DNA在長期的環境中

10、已經遭受了嚴重損傷和降解34,35,36，因此在提取過程中應避免再次受損，特別是過度腐蝕性處理，例如高溫或使用強力表面活性劑37。盡管這些處理可能會增加DNA的釋放，但它們會對古DNA分子造成進一步的損傷，從而降低DNA的總產量。古代骨骼和牙齒通常含有大量的PCR抑制劑38,39，它們干擾DNA擴增，并與古DNA一起被純化。現在越來越多的研究除了使用線粒體序列外，還使用核DNA序列，與線粒體DNA相比，核DNA在活細胞中的拷貝數要低得多，因此很難從低質量的樣本中獲得。因此，獲得高質量的內源性的DNA一直是古DNA提取方法不斷改進的方向。為了提高古DNA的回收率，近年來出現了多種優化的古DNA提

11、取技術。本文綜述了一些具有代表性的古DNA提取方法，并比較了各種方法的優缺點，對古DNA的提取提供參考和借鑒。2、 骨粉樣品的預處理盡管近些年在古DNA提取方法的改進方面已經取得了很大進展，但由于微生物或現代人類DNA的大量污染，也經常會出現一些樣本仍然無法進行分析。通過化學或酶處理是避免不同來源的現代人類或微生物DNA污染的有效方法，適當的預處理可以提高內源性古DNA的獲得。骨粉樣品的預處理已經報道了很多方法，包括用磷酸鹽緩沖液、次氯酸鈉緩沖液18、蛋白酶40、EDTA或酸處理骨骼或骨粉41。以下概述了三種典型的骨粉預處理方法和其在古DNA研究中的應用。2.1、 次氯酸鈉預處理次氯酸鈉處理骨

12、頭或骨粉41,42是法醫學研究中最常用的去除外源DNA污染的方法，也被用于古代DNA的研究43。在不同的研究中，關于次氯酸鈉去污染效率的報道各不相同，從使用≥3%的次氯酸鈉溶液41完全去除人體污染物到不考慮次氯酸鈉濃度的不完全去除污染物。然而，據報道，次氯酸鈉處理骨粉后，大約四分之三的內源性DNA丟失44。Korlevi?18對不同濃度下，次氯酸鈉溶液處理后的內源性古DNA的丟失和損傷程度進行了對比研究。他將250mg骨粉分成五等分，除了設置的一個空白對照，其余四份分別加入0.1%、0.5%、2%和6%濃度的次氯酸鈉溶液。然后用EDTA/蛋白酶K裂解液進行孵育完成古DNA的釋放，最后用二

13、氧化硅方法進行純化45。通過檢測古DNA文庫分子量和shotgun測序之后的古DNA片段長度的對比分析，發現使用0.5%次氯酸鈉溶液處理的骨粉樣品，雖然古DNA有一定程度的丟失，但是不會對古DNA造成損傷18。在重建3.9萬至4.7萬年前尼安德特人的遺傳歷史研究中，大量尼安德特人內源性古DNA保存不善且受到大量微生物和現代人類DNA的污染。當骨粉或牙粉進行次氯酸鹽處理后再進行古DNA的提取，有效的去除了外源污染物，增加了內源性古DNA的釋放率和提取效率，使得五個尼安德特人的基因組覆蓋率提高了1到2.7倍，且獲得有效的基因組序列的尼安德特人樣本數量增加了一倍46。2.2 、基于EDTA/蛋白酶的

14、預消化骨粉在裂解過程中，骨結構降解，增加了骨的孔隙和總表面積17。與外源污染物相比，內源性古DNA位于更受保護的骨晶體內47。在骨材料的消化過程中，表面污染物將首先釋放到溶液中48。因此，在短時間內用預消化緩沖液處理磨碎的骨材料會去除一部分外源性非靶向DNA，從而提高內源性DNA的富集效率。預消化是一種簡單有效的方法，可以從古代樣本中去除一定比例的外源DNA。研究表明，基于EDTA酶（EDTA和蛋白酶）預消化骨骼粉末可將內源性DNA的比例提高數倍。使用較短的預消化時間（15-30分鐘），在50°C下孵育，獲得的內源性DNA是未使用預消化的14倍。但隨著長時間的預消化，會影響內源性古DN

15、A的回收率48。對西伯利亞東北部晚更新世的人類歷史研究中，在發現的距今3.1萬至600年前的34個古人類DNA進行提取之前，骨粉中加入0.5M EDTA，蛋白酶K,100×TE和10%N-Laurylsarcosyl，在40°C環境中預消化45 min，盡可能多得排除了外源DNA的污染，并獲得了有效和可靠的全基因組序列49。該項研究進一步說明了EDTA酶的預消化作用同樣適用于從3.1萬600年前這樣大跨度時間范圍內的古DNA提取。2.3 、磷酸鹽緩沖液預處理古DNA與羥基磷灰石是通過帶正電的鈣離子與DNA分子中帶負電的磷酸基團吸附而相互作用的。而游離的磷酸鹽離子與DNA主鏈

16、上的磷酸基團相互競爭結合到羥基磷灰石上50,51，使得DNA游離于溶液中，這一原理通常在液相色譜中用于分離核酸50。同時磷酸鹽緩沖液預處理也被用于古DNA的提取中的外源DNA的去除52,53。Korlevi?18對磷酸鈉緩沖液預處理條件進行了研究，使用歐亞大陸晚更新世骨骼和牙齒樣本，加入0.5 M磷酸鈉緩沖液，p H 7.0，常溫振蕩孵育，并預處理三次，研究發現大多數污染物DNA在第一次磷酸鹽孵育過程中被釋放出來，當縮短第一次孵育培養時間時，可能會獲得更有利的結果。所以建議每次孵育時間使用15 min，可有效的將外源DNA先釋放到溶液中得以去除。3、 裂解時間的研究骨粉的裂解時間直接影響古DN

17、A的釋放和回收率，裂解時間如果不夠，古DNA不能完全從骨骼晶體內釋放出來。如果裂解時間過長和孵育溫度過高，又會導致古DNA進一步損傷。骨粉裂解常用的孵育溫度為37，因為此溫度下蛋白酶K的活性最高54,55，裂解時間通常為1624小時56。對于骨粉顆粒比較大的樣品來說，裂解完成后在56溫度下，再次孵育13小時，可以增加更多古DNA的釋放57。也有研究在使用預處理過程時，首先加入0.5M EDTA(p H 8.0）去除樣本表面污染物和保持DNA的穩定性，常溫孵育24小時，離心收集沉淀物，加入蛋白酶K和DTT,5055溫度下孵育24小時2，使DNA完全釋放到溶液中。為了防止溫度的升高對古DNA的進一

18、步損傷，我們研究了在常溫下，不同的孵育時間對DNA提取效率的影響。研究樣本來自于仰韶文化晚期的五莊果墚遺址，該遺址位于陜西省靖邊縣黃蒿界鄉小界村。選取了其中一具遺骸中的六顆牙齒并研磨成粉末，將同一骨粉樣品分裝為200 mg、500 mg和1 g各五等份，分別加入裂解緩沖液（0.45 M EDTA和0.25 mg/ml的蛋白酶K,p H 8.0），恒溫裂解搖床轉速設為250r/min振蕩孵育。同一骨粉量的5個等分樣品孵育時間分別設為24、48、72、96和120小時，孵育時間超過48小時添加一次0.25 mg/ml的蛋白酶K。孵育完成后用二氧化硅層析柱進行純化（Qiagen,28004），再加入

19、30μl的TE緩沖液（10 m M Tris,1 m M EDTA,p H 8.0）進行洗脫，得到古DNA提取液。用微量紫外分光光度計對古DNA提取液進行濃度的初步檢測，檢測到的為總的DNA濃度，其中除了內源性古DNA還包括了微生物DNA。然后用現代人的基因組，擴增預先設計好的一段序列并確定其濃度，用已知濃度的現代人DNA樣品制備出具有穩定擴增的DNA溶液作為參照（標準品），借助實時熒光定量PCR(Polymerase Chain Reaction,PCR）對古DNA提取液進行擴增，參照已知濃度的標準品梯度范圍，計算排除微生物DNA污染的古DNA起始濃度。制備標準品的過程是：首先，根據需

20、要設計擴增引物（F15977-R16509:5’-CCACCATTAGCACCCAAA-3’-5’-AGGAACCAGATGTCGGATA-3’），以現代人基因組為模版擴增目標片段，用瓊脂糖凝膠電泳進行目標片段的分離和純化，將目標片段克隆進質粒載體，構建含有目標片段的重組質粒，以重組質粒作為模版進行擴增，并選擇適合檢測古DNA起始濃度的標準品濃度梯度，將制備的標準品與古DNA提取液同時進行實時熒光定量PCR，以標準品作為參照，計算古DNA的起始模板量。實時熒光定量PCR結果如圖1所示，結合PCR實時監測的擴增曲線（左側）和標準曲線（右側），對比2

21、00mg、500mg和1g骨粉在不同裂解時間下的濃度變化，研究結果發現常溫孵育96小時（4天）獲得的DNA濃度最大，而孵育120小時后濃度稍有降低，表明孵育時間超過96小時后，DNA可能開始出現明顯的降解。所以我們建議如果是在常溫條件下孵育進行骨粉裂解過程，孵育時間使用96小時為宜。圖1 常溫條件下不同的孵育時間對DNA提取效率的影響Fig.1 The effect of different incubation time on DNA extraction efficiency at room temperature注：左側為擴增曲線，X軸對應PCR擴增循環數，Y軸對應熒光強度值；右側為標準

22、曲線，X軸為模板的起始拷貝數的對數，Y軸為每個反應熒光信號到達設定閾值時所經歷的循環數。a 200mg骨粉在5個不同裂解時間下的擴增曲線和標準曲線；b 500mg骨粉在5個不同裂解時間下的擴增曲線和標準曲線；c 1g骨粉在5個不同裂解時間下的擴增曲線和標準曲線。4 、古DNA純化方法4.1、 基于二氧化硅（硅粒）的古DNA純化當溶液的p H值低于或等于二氧化硅表面電離常數時，二氧化硅表面攜帶的負電荷減少，因而與DNA分子帶的負電荷之間的排斥力也隨之減弱，會形成很多的水合離子，降低了DNA分子的水合程度，從而DNA分子集聚到二氧化硅的表面。收集DNA時，先用洗滌緩沖液洗掉吸附有DNA分子的二氧化

23、硅表面的其他雜質，再用p H值高于電離常數的溶液洗脫吸附在二氧化硅表面上的DNA分子，從而獲得DNA提取液。在二氧化硅顆粒純化古DNA方法中，所有的步驟都是在室溫（20-23）下進行的，從而減少了對脆弱的古DNA造成進一步損傷，并去除了古代骨骼樣本中存在的大多數不同類型的PCR抑制劑，為后續古DNA實驗操作（如PCR擴增）提供穩定環境。該方案可方便地適用于不同樣品量的骨粉和提取體積。該方法操作步驟較少，需要的設備簡單，可在2個工作日內完成古DNA的提取。但是在實際操作中，如果操作不慎易造成吸附DNA的二氧化硅顆粒的外濺和損耗，會降低古DNA的回收率。4.2 、硅離心柱純化古DNA古DNA提取中

24、常用的二氧化硅離心柱主要分兩種，一種是直接采用商業化的硅膠離心柱（Qiagen,28004)58,59對古DNA進行富集；另一種是通過優化商業化的色譜柱，得到更高效的富集古DNA的硅離心柱：首先將二氧化硅顆粒固定在1μm孔徑的色譜膜中（Whatman,1.0μm），然后將固定有二氧化硅顆粒的色譜膜放入商業化的色譜柱中60(Mobicols,M1002S,10μm孔徑）。這種改良的二氧化硅離心柱在古DNA提取中也被廣泛的應用61,62。直接采用商業化的硅膠離心柱操作簡便、大大減少了提取時間和人力的消耗，但是商業化的硅膠離心柱會使古DNA的回收效率受到產品本身的影響，比如受硅膠的

25、粒徑、密度、純度和固定方式等因素的影響，會使古DNA的吸附和洗脫效率有很大差別。在實際應用中，我們發現用Qiagen品牌下的Min Elute硅膠離心柱對古DNA的回收效率明顯優于國產的某些硅膠離心柱。另外，商業化的硅膠離心柱回收的DNA產量是有限的37，且通常不適合大樣本體積量的使用。用商業化的色譜柱優化的二氧化硅離心柱可以防止在離心過程中，細小的二氧化硅顆粒的丟失。但是用色譜柱制備成二氧化硅離心柱過程較為繁瑣，增加操作步驟和工作量，容易將外源DNA污染再次引入古DNA提取。4.3 、磁珠法純化古DNA磁珠法提取DNA常用的是硅質膜二氧化硅磁珠，是由超順磁性內核和二氧化硅外殼組成，表面修飾大

26、量的硅羥基。磁珠表面的硅羥基能夠與溶液中的核酸通過氫鍵和靜電作用發生特異性結合，在高鹽條件下與核酸結合，而在低鹽環境下被洗脫，在外加磁場作用下，磁性顆粒與溶液分離，回收磁珠顆粒（即磁珠-DNA混合物），即可以直接從復雜生物體系中迅速分離核酸63。該方法也被應用于古DNA的提取64，從新石器時期（5000年前）的遺骸材料中，成功提取了古DNA，并完成了線粒體DNA的擴增和分析。值得注意的是，該方法在整個純化過程不需要離心，簡化了古DNA提取步驟，大大縮短了提取時間，易于操作，成本低廉，設備需求簡單。4.4 、乙醇/異丙醇沉淀法純化古DNA根據乙醇和異丙醇能夠沉淀核酸，實現DNA的分離和純化的原理

27、，被應用于古DNA的提取。異丙醇比乙醇沉淀DNA的效果要好，因為異丙醇比較疏水，可以較好的沉淀和分離DNA。但是乙醇比異丙醇更加親水，能夠有效的去掉鹽離子，且易于揮發，對下游的實驗影響較小。所以在沉淀核酸時，通常在使用異丙醇之后，再用70%的乙醇多次洗滌脫鹽。這種方法快速，既不需要危險化學品，也不需要特殊的設備，可以減少耗時的分離脫鈣步驟、透析、離心驅動的微濃縮等過程65。乙醇/異丙醇沉淀法對于血液樣本DNA提取具有很好的效果，操作簡便、成本低廉、提取的DNA質量高，但是對于古DNA的提取卻存在弊端。古DNA含量極低，在乙醇/異丙醇沉淀的過程中，很難看到白色絮狀沉淀物，在DNA抓取中容易漏掉一

28、定量的古DNA。古DNA高度片段化，有相當一部分片段小于100bp；對于分子量極小的古DNA片段，在乙醇/異丙醇沉淀離心后，很難回收到短片段的古DNA，這樣就會造成內源性古DNA的丟失。5、討論與結語從古代原始材料中提取DNA方法有很多種，樣品預處理和提取過程需要考慮不同來源的現代和微生物DNA的污染。能否從古代人類遺骸中成功獲取內源性古DNA并進行深入研究分析，一直是古DNA研究領域面臨的實際困難和挑戰。控制污染最直接的手段就是古DNA提取階段，骨粉的預處理過程可以大幅度排除古代遺骸中微生物和現生人類DNA的污染。但在去除污染的過程中，有些預處理方法又會帶來新的問題，比如次氯酸鈉緩沖液預處理

29、可以增加古DNA的釋放率和序列匹配率，濃度的使用不當很容易造成內源性古DNA損傷；磷酸鹽緩沖液也會增加古DNA序列的匹配率（使用磷酸鹽緩沖液預處理，古DNA序列的匹配率會增加兩倍，而用次氯酸鈉預處理古DNA的匹配率會增加4.6倍18），但是內源性古DNA釋放得較少18。雖然次氯酸鈉和磷酸鹽處理可有效去除微生物DNA的污染，且大大降低了古代材料基因組測序的成本，但去除人類污染方面表現著低效性18。需要注意的是，文庫中污染的百分比并不一定反映骨粉中存在的污染水平，因為一些現代人類DNA污染是在實驗室操作中引入的。次氯酸鈉處理的骨粉尤其如此，內源性DNA分子的大量丟失放大了人類污染的影響，次氯酸鈉處

30、理不能保證去除人類污染42,44，導致文庫中現生人類DNA污染的百分比增加，因此不適用于不能重復取樣的小而珍貴的標本。研究發現對同一骨粉樣品用EDTA和蛋白酶進行預消化處理，內源性古DNA相對于微生物和現代人類污染的比例明顯增加了47,48,66。但是此預消化過程需在50°C下孵育，應盡量減少孵育時間，通常為15-30分鐘，以免長時間的預消化，內源性古DNA增加達到飽和，使得古DNA濃度下降。骨粉的裂解溫度和時間會影響古DNA的釋放和回收率，為了防止孵育溫度的升高對古DNA的進一步損傷。我們研究了常溫環境下，200 mg、500 mg和1 g不同骨粉量，在裂解緩沖液（0.45 M ED

31、TA和0.25 mg/ml的蛋白酶K）的作用下，不同的裂解時間對古DNA的回收率的影響，研究發現在常溫環境中裂解骨粉的最佳時間為4天（96小時）。也有研究將無損提取方法67,68用于古代骨骼和牙齒材料古DNA提取中，為了避免在研磨過程中對古DNA的進一步損傷，將古代樣本材料直接浸泡在裂解緩沖液中，待古DNA完全釋放進行純化分析。無損古DNA提取方法也會得到較好質量的古DNA。但經過無損方法處理后的樣本材料顏色變得更淺，而且出現比以前更多的空隙，這些結果似乎表明，無損提取技術雖然不會破壞原始樣本材料外在的形貌，但也會損害材料內部的結構69。古DNA的純化回收方法多種多樣，主要是基于二氧化硅（硅粒

32、）、商業化的凝膠柱或自制的回收柱和醇類沉淀等方法。在使用這些方法時，古DNA的富集和回收效率會受很多外因的影響，比如DNA結合緩沖液的PH，富集DNA的硅膠或硅粒的結構、比表面積、質地，以及純度等因素的影響。特別是購買的商業化的硅離心柱，不同廠家的產品，富集和回收效率也會存在差異，并通常不適合大樣本量使用，且存在現生人群DNA污染的風險。對于較大樣本體積，還需要注意的是使用的結合緩沖液和洗滌緩沖液時，需要盡量避免鹽類和雜質融入古DNA提取液，以免影響后續建庫、擴增和測序等過程的順利進行。一些人認為古材料中存在的DNA都是現代污染物造成的，所以符合古DNA研究標準的超凈實驗室和實驗員操作過程中的

33、嚴格防護，可以降低現生人群DNA的污染幾率。適當的獨立對照實驗的引入，可以確認研究樣本DNA的真實性，還可以確保不會錯誤地從微生物序列中進行擴增。古DNA的研究受限于DNA保存環境，微生物DNA含量高，現生人群的DNA污染等因素的影響。雖然古DNA提取技術在不斷改進，篩選內源性古DNA片段的方法不斷在優化，獲得可靠和足量的古DNA序列信息仍然面臨著巨大考驗。而降低古DNA污染最有效和方便的階段就是在古DNA提取階段的污染防控，本文整理了古DNA提取常用的去除污染的手段，對比分析了每種去污染方法表現出來的優缺點。總結了通常使用的骨粉裂解時間，并研究了在常溫環境下，不同的裂解時間對古DNA回收效率

34、的影響，提出了常溫裂解過程最佳的孵育時間。此外，骨粉裂解完成后的純化方法呈現多樣性，列舉了常用的純化方法的基本原理，以及在古DNA研究應用中的表現進行了整理和總結。本文對古DNA提取技術進行了概述和討論，希望為從事古DNA領域研究的學者們提供借鑒與參考。參考文獻1 Campos PF, Willerslev E, Sher A, et al. Ancient DNA analyses exclude humans as the driving force behind late Pleistocene musk ox(Ovibos moschatus)population dynamicsJ.

35、 Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2010, 107(12):5675-56802 Leonard JA, Wayne RK, Cooper A. Population genetics of ice age brown bearsJ. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2000, 97(4):1651-16543 Pinsky ML, Ne

36、wsome SD, Dickerson BR, et al. Dispersal provided resilience to range collapse in a marine mammal:insights from the past to inform conservation biologyJ. Mol Ecol, 2010, 19(12):2418-24294 Shapiro B, Drummond AJ, Rambaut A, et al. Rise and fall of the Beringian steppe bisonJ. Science, 2004, 306(5701)

37、:1561-15655 Stiller M, Baryshnikov G, Bocherens H, et al. Withering away-25,000 years of genetic decline preceded cave bear extinctionJ.Mol Biol Evol, 2010, 27(5):975-9786 Ning C, Li TJ, Wang K, et al. Ancient genomes from northern China suggest links between subsistence changes and human migrationJ

38、. Nature communications, 2020, 11(1):27007 Wang K, Goldstein S, Bleasdale M, et al. Ancient genomes reveal complex patterns of population movement, interaction, and replacement in sub-Saharan AfricaJ. Science Advance, 2020, 6 eaaz01838 Narasimhan VM, Patterson N, Moorjani P, et al. The Genomic Forma

39、tion of South and Central AsiaJ. bio Rxiv, 2018,9 Green RE, Krause J, Briggs AW, et al. A draft sequence of the Neandertal genomeJ. Science, 2010, 328(5979):710-72210 Shapiro B, Sibthorpe D, Rambaut A, et al. Flight of the DodoJ. Science, 2002, 295168311 Krause J, Unger T, Nocon A, et al. Mitochondr

40、ial genomes reveal an explosive radiation of extinct and extant bears near the Miocene-Pliocene boundaryJ. BMC Evol Biol, 2008, 822012 Orlando L, Metcalf J, Alberdi M, et al. Revising the recent evolutionary history of equids using ancient DNAJ. Proc Natl Acad Sci USA, 2009, 10621754-2175913 Barquer

41、a R, Krause J. An ancient view on host-pathogen interaction across time and spaceJ. Current opinion in immunology,2020, 6565-69.14吳苡婷古DNA檢測技術在抗擊新冠中的特殊作用N上海科技報，2020.15 Collins MJ, Nielsen-Marsh CM, Hiller J, et al. The survival of organic matter in bone:a reviewJ. Archaeometry, 2002, 44(3):383-39416

42、Hofreiter M, Paijmans JL, Goodchild H, et al. The future of ancient DNA:Technical advances and conceptual shiftsJ. Bioessays,2015, 37(3):284-29317 Campos PF, Craig OE, Turner-Walker G, et al. DNA in ancient bone-where is it located and how should we extract it?J. Ann Anat, 2012, 194(1):7-1618 Korlev

43、ic P, Gerber T, Gansauge MT, et al. Reducing microbial and human contamination in DNA extractions from ancient bones and teethJ. Bio Techniques, 2015, 59(2):87-9319 Lindahl T. Instability and decay of the primary structure of DNAJ. Nature, 1993, 362709-71520 Brundin M, Figdor D, Sundqvist G, et al.

44、DNA binding to hydroxyapatite:a potential mechanism for preservation of microbial DNAJ. J Endod, 2013, 39(2):211-21621 Svintradze DV, Mrevlishvili GM, Metreveli N, et al. Collagen–DNA ComplexJ. Biomacromolecules, 2008, 921-2822 Reich D, Green RE, Kircher M, et al. Genetic history of an archaic

45、 hominin group from Denisova Cave in SiberiaJ. Nature, 2010,468(7327):1053-106023 Prufer K, Racimo F, Patterson N, et al. The complete genome sequence of a Neanderthal from the Altai MountainsJ. Nature,2014, 505(7481):43-4924 Gamba C, Jones ER, Teasdale MD, et al. Genome flux and stasis in a five-mi

46、llennium transect of European prehistoryJ. Nature,communications, 2014, 5525725 Burbano HA, Hodges E, Green RE, et al. Targeted Investigation of the Neandertal Genome by Array-Based SequenceJ. Science,2010, 328723-72526 Avila-Arcos MC, Cappellini E, Romero-Navarro JA, et al. Application and comparis

47、on of large-scale solution-based DNA captureenrichment methods on ancient DNAJ. Sci Rep, 2011, 17427 Fu QM, Meyer M, Gao X, et al. DNA analysis of an early modern human from Tianyuan Cave, ChinaJ. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2013, 110(6):2223-2227

48、28 Carpenter ML, Buenrostro JD, Valdiosera C, et al. Pulling out the 1%:whole-genome capture for the targeted enrichment of ancient DNA sequencing librariesJ. Am J Hum Genet, 2013, 93(5):852-86429 Castellano S, Parra G, Sanchez-Quinto FA, et al. Patterns of coding variation in the complete exomes of

49、 three NeandertalsJ.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2014, 111(18):6666-667130 Meynert AM, Ansari M, Fitz Patrick DR, et al. Variant detection sensitivity and biases in whole genome and exome sequencingJ.BMC Bioinformatics, 2014, 1524731 Briggs AW, Ste

50、nzel U, Johnson PLF, et al. Patterns of damage in genomic DNA sequences from a NeandertalJ. Proc. Natl. Acad.Sci, 2007, 10414616-1462132 Gansauge MT, Meyer M. Selective enrichment of damaged DNA molecules for ancient genome sequencingJ. Genome Res, 2014,24(9):1543-154933 Geigl E. On the circumstance

51、s surrounding the preservation and analysis of very old DNAJ. Archaeometry, 2002, 44337-34234 H?ss M, Dilling A, Currant A, et al. Molecular phylogeny of the extinct ground sloth mylodon darwiniiJ. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1996, 93181-18535 Han

52、sen AJ, Mitchell DL, Wiuf C, et al. Crosslinks rather than strand breaks determine access to ancient DNA sequences from frozen sedimentsJ. Genetics, 2006, 1731175-117936 Hofreiter M, Jaenicke V, Serre D, et al. DNA sequences from multiple amplifications reveal artifacts induced by cytosine deaminati

53、on in ancient dnaJ. Nucleic Acids Research, 2001, 294793-479937 Rohland N, Hofreiter M. Comparison and optimization of ancient DNA extractionJ. Bio Techniques, 2007, 42343-35238 Tebbe CC, Vahjen W. Interference of humic acids and DNA extracted directly from soil in detection and transformation of re

54、combinant DNA from bacteria and a yeastJ. Appl Environ Microbiol, 1993, 592657–266539 Tuross N. The biochemistry of ancient DNA in boneJ. Experientia, 1994, 50530-53540 Li R, Liriano L. A bone sample cleaning method using trypsin for the isolation of DNAJ. Leg Med(Tokyo), 2011, 13(6):304-30841

55、 Kemp BM, Smith DG. Use of bleach to eliminate contaminating DNA from the surface of bones and teethJ. Forensic Sci Int,2005, 154(1):53-6142 Barta JL, Monroe C, Kemp BM. Further evaluation of the efficacy of contamination removal from bone surfacesJ. Forensic Sci Int, 2013, 231(1-3):340-34843 Salamo

56、n M, Tuross N, Arensburg B, et al. Relatively well preserved DNA is present in the crystal aggregates of fossil bonesJ.PNAS, 2005, 102(39):13783-1378844 Malmstrom H, Svensson EM, Gilbert MT, et al. More on contamination:the use of asymmetric molecular behavior to identify authentic ancient human DNAJ. Mol Biol Evol, 2007, 24(4):998-100445 Dabney J, Knapp M, Glocke I, et al. Complete mitochondrial genome sequence of a Middle Pleistocene cave bear reconstructed from ultrashort DNA fragmentsJ. Proceedings