1、實驗一卷心菜中過氧化物酶熱穩定性的初步研究一、實驗原理果蔬中的過氧化物酶（peroxidase）往往具有較高的熱穩定性，對果蔬進行熱燙處理時，常以過氧化物酶是否失活作為熱燙是否充分的標準。許多研究表明果蔬中的過氧化物酶有熱穩定和熱不穩定兩部分。這兩部分的比例取決于果蔬的品種和熱燙處理的溫度。過氧化物酶催化的典型反應為：HO+AH-A+2H0。2222AH是無色的還原性化合物，如果它經過氧化轉變成有色的A,那么反應體2系在特定波長下的吸光值就會隨反應進行而增加。因此，可以用分光光度法測定過氧化物酶的活力。二、試劑和儀器試劑：0.05mol/L磷酸鹽緩沖液pH7.0,含1.0mol/LNaCl（緩

2、沖液I）、O.lmol/L磷酸鹽緩沖液pH7.0（緩沖液II）、1%鄰苯二胺-乙醇溶液、0.3%過氧化氫溶液儀器：組織搗碎機、抽濾裝置、水浴鍋、721分光光度計（含比色皿）、秒表、常規玻璃儀器三、實驗步驟1、從卷心菜中提取過氧化物酶125g卷心菜+125mL緩沖液I!均質（20000rpm,2min）勻漿!抽濾液體!離心（8000rpm,15min，4C）殘渣濾過液（粗酶液）2、過氧化物酶熱處理將從卷心菜中萃取得到的過氧化物酶粗酶液置于試管中。取適量酶液稀釋5倍左右，過濾后測定酶活。另取適量酶液分別置于已編號的試管中，將試管在60C水浴中保溫1min,然后移至85C水浴鍋中，分別處理0.5mi

3、n、lmin、1.5min、2min、3min、5min、7min和10min，然后立即將試管轉移至冰浴中，快速冷卻至0C。再取適量酶液分別置于已編號的試管中，并將試管在60C水浴中保溫lmin,然后在100C下分別處理15s、30s、45s、1min、1.5min、2min和3min，然后在冰浴中快速冷卻，測定殘余過氧化物酶活力。3、過氧化物酶活力測定如果熱處理后酶液中產生混濁，應在比色前過濾去除沉淀。向比色皿中加入2.6mL緩沖液II,0.1mL鄰苯二胺-乙醇溶液，0.2mL過氧化氫溶液，然后加入0.1mL酶液，并立即攪勻計時，在430nm下測定反應混合物的吸光值隨時間的變化。空白以緩沖液

4、代替酶液。根據吸光值變化情況調節加酶量，保持酶液和緩沖液體積之和恒定。四、數據記錄與處理1、粗酶液活力測定數據時間/S102030405060708090100110120吸光度0.1050.1870.2620.3420.4270.5080.5940.6820.7730.8670.9661.062用Excel處理數據，得到下圖，加酶量0.1mL，稀釋倍數為5（1mL原酶液+4mL蒸餾水）。由圖可知：直線的斜率為0.5198，也就是說每分鐘吸光度值上升0.5198。由于稀釋倍數為5倍，加酶量為0.1mL，因此計算得出酶活力為0.5198x5O=25.99U/mL。2、85C熱處理后殘余酶活測定數

5、據熱處理時間不同的幾組樣品在不同稀釋倍數及加酶量條件下分別測定了消光值,如下表：熱處理消光值時間/s10203040506070809010011012085C0.5min0.0450.0880.1380.1880.2400.2930.3480.4050.4640.5230.5850.64985C1.0min0.0470.0910.1360.1810.2290.2780.3270.3790.4320.4860.5410.59985C1.5min0.0150.0320.0540.0750.0970.1190.1410.1650.1880.2110.2340.25985C2.0min0.0420.

6、0780.1170.1550.1930.2340.2750.3170.3610.4060.4520.49985C3.0min0.0060.0120.0180.0250.0310.0380.0440.0520.0590.0660.0740.08285C5.0min0.0040.0040.0050.0060.0080.0090.0110.0130.0150.0170.0190.02185C7.0min0.0040.0030.0040.0040.0040.0030.0040.0040.0040.0040.0040.00485C10.0min0.0030.0030.0030.0030.0030.003

7、0.0030.0030.0030.0030.0030.003數據處理如下圖:00.511.522.5時間(min)（85C,30秒，稀釋4倍，加酶量O.ImL）2J-J00.511.522.5時間(min)（85C,60秒，稀釋3倍，加酶量O.ImL）（85C,90秒，稀釋2倍，加酶量O.ImL）（85C,120秒，稀釋1倍，加酶量O.ImL）（85C，180秒，稀釋1倍，加酶量O.ImL）0.0250.02-鰹0.015-薈0.01-0.005-0-00.511.522.5時間(min)（85C,300秒，稀釋1倍，加酶量O.ImL）（85C,420秒，稀釋1倍，加酶量0.1mL）0.003

8、50.0030.0025鄴0.002薈0.0015y=0.0030=0.00000.0010.00050.51.52.5時間(min)（85C，600秒，稀釋1倍，加酶量0.1mL）3、100C熱處理后殘余酶活測定熱處理時間不同的幾組樣品在不同加酶量條件下分別測定了消光值，如下表:熱處理消光值時間/s102030405060708090100110120100C0.25min0.0820.1440.2080.2750.3430.4140.4870.5640.6430.7240.8090.897100C0.5min0.1350.1760.2230.2830.3410.4040.4690.5360

9、.6050.6750.7480.825100C0.75min0.0040.0080.0120.0170.0210.0240.0290.0330.0380.0430.0470.052100C1.0min0.0050.0080.0110.0140.0170.0210.0250.0280.0310.0340.0380.042100C1.5min0.0880.0930.0960.1000.1070.1090.1140.1170.1220.1270.1310.135100C2.0min0.0870.0910.0910.0920.0930.0940.0950.0990.0960.0980.0980.099

10、100C3.0min0.0980.0980.0970.0980.0980.0980.0990.0990.0990.0990.1000.100數據處理如下面一系列圖:00.511.522.5時間(min)（100C,15秒，稀釋4倍，加酶量0.1mL）00.511.522.5時間(min)（100C,30秒，稀釋3倍，加酶量0.1mL）（100C,45秒，稀釋2倍，加酶量0.1mL）（100C,60秒，稀釋1倍，加酶量0.1mL）（100C，90秒，稀釋1倍，加酶量0.1mL）0.1050.1鰹0.095穆0.090.0850.08L00.511.52.5時間(min)（100C,120秒，稀釋

11、1倍，加酶量O.ImL）時間(min)（100C,180秒，稀釋1倍，加酶量0.1mL）4、酶活計算Excel處理數據熱處理條件酶液稀釋加酶量酶活相對殘余活相對殘余活所的斜率倍數/mL/U/mL力（）力對數0.5198無50.125.99100.02.0000.330385C熱處理0.540.113.21250.8351.7060.300585C熱處理130.19.01534.6861.4820.134185C熱處理1.520.12.68210.3191.01360.248885C熱處理2未0.10.24880.957-0.01910.041385C熱處理3未0.10.04130.1589-0

12、.79890.009885C熱處理5未0.10.00980.0377-1.42370.000285C熱處理7未0.10.00020.0000077-5.1140.000085C熱處理10未0.10.00000-0.4435100C熱處理0.2540.117.7468.2571.8340.3810100C熱處理0.530.111.4343.9781.6430.0261100C熱處理0.7520.10.5222.00850.30290.0201100C熱處理1未0.10.02010.0773-1.11180.0256100C熱處理1.5未0.10.02560.0985-1.00660.006910

13、0C熱處理2未0.10.00690.0265-1.5770.0013100C熱處理3未0.10.00130.00005002-4.30095、相對殘余活力一熱處理時間曲線和相對殘余活力對數一熱處理時間曲線在相對殘余活力一熱處理時間曲線中，最初的直線部分代表酶的熱不穩定部分失活，中間曲線部分可以認為是過渡區域，而最后的直線部分表示耐熱部分的失活，擬合最后平緩部分并延長（取最后三個點）可以得出它與縱坐標的交點，由此可以估算出耐熱部分活力占酶的總活力的比例。曲線如下圖：由圖中可知，85C熱處理時，卷心菜中過氧化物酶耐熱部分所占比例約為-0.0397，而100C熱處理時，其比例僅占-0.0508.2-525150y=-0L636fix42.0279IT2=0.9T582-525