1、蛋白質測序策略： 確定蛋白質的純度在97%以上； 測定多肽鏈的數目； 拆分多肽鏈； 分析每一條多肽鏈的氨基酸組成； 鑒定多肽鏈的N-末端和C-末端氨基酸殘基； 用兩種以上方法把多肽鏈裂解成較小的肽段； 測定各肽段的氨基酸序列； 把各肽段拼接成完整的多肽鏈； 確定二硫鍵的位置。2、蛋白質組學的研究特點： 同一性與多樣性、有限與無限、 靜態與動態、 時間與空間孤立行為與相互作用、單一手段和多種技術、互補與互助3、蛋白質組學研究任務內容：了解某種特定的細胞、組織或器官制造的蛋白質種類、明確各種蛋白質分子是如何讓形成類似于電路的網絡的、描繪蛋白質的精確三維結構，揭示其結構上的關鍵部分，如與藥物結合并且決定其活性的部位當前任務：發展高通量、高靈敏度、高準確性的研究技術平臺研究目的：分離蛋白，顯示差異，將表現型與功能聯系起來； 尋找蛋白質之間的相互作用，動態地反映生物體所處的狀態。4、蛋白質組學研究的兩種策略：1) “竭澤法：采用高通量的蛋白質組研究技術分析生物體內盡可能多的乃至全部的蛋白質。2) “功能法”：研究不同時期細胞內蛋白質組成的變化，如蛋白質在不同環境下的差異表達，以發現有差異的蛋白質種類為主要目標5、蛋白質化學和蛋白質組學的不同蛋白質化學 蛋白質組學單一蛋白質 復雜混合物全序列分析 部分序列分析強調結構與功能 強調通過數據庫匹配進行蛋白質鑒定結構生物學 系統生物學6、氨基酸的分類及結構特點1) 非極性R基氨基酸 Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Trp、Met共 8 種，這類氨基酸在水中的溶解度較小；2) 極性R基氨基酸 不帶電荷的極性 R 基氨基酸 Ser、Thr、Tyr、Asn、Gln、Cys、Gly 帶正電荷的 R 基氨基酸 Lys、Arg、His 帶負電荷的 R 基氨基酸 Asp、Glu 7、脂肪族氨基酸：甘氨酸 Glycine 、丙氨酸Alanine 、纈氨酸 Valine、亮氨酸 Leucine異亮氨酸 Ileucine亞氨基酸：脯氨酸 Proline 含硫氨基酸 ：甲硫氨酸 Methionine、半胱氨酸Cysteine 芳香族氨基酸 ：苯丙氨酸Phenylalanine 、酪氨酸 Tyrosine 、色氨酸 Trytophan 堿性氨基酸 ：精氨酸 Arginine 、賴氨酸 Lysine 、組氨酸 Histidine 酸性氨基酸 ：天冬氨酸 Aspartate 、谷氨酸 Glutamate 含羥基氨基酸 ：絲氨酸 Serine 含酰胺氨基酸 ：天冬酰胺 Asnaragine 、谷氨酰胺 Glutamine 8、殘基：在肽鏈中氨基酸之間脫去一個水分子，脫水后的殘余部分叫殘基 (residue)，因此蛋白質肽鏈中的氨基酸統統是殘基形式。9、氨基酸的特性：一般一氨基一羧基的氨基酸等電點在pH 6左右，這是由于羧基的解離程度大于氨基，故pI偏酸，堿性氨基酸pI在pH 10左右，酸性氨基酸的pI在pH 3左右。 氨基酸水溶液中其解離度與溶液的pH有關：向氨基酸溶液中加酸時，羧基接受質子，使氨基酸帶正電，加堿時，氨基釋放質子，與OH-中和，使氨基酸帶負電。當溶液的pH=pI時，氨基酸以兩性離子存在當溶液的pHpI時，氨基酸溶液中正離子占優勢當溶液的pHpI時，氨基酸溶液中負離子占優勢。10、氨基酸的化學性質與亞硝酸的反應 Van Slyke定氮與甲醛的反應 氨基滴與酰化試劑的反應 氨基保護基與二甲基氨基萘磺酰氯 (DNS-Cl)的反應 測序與2,4-二硝基氟苯 (FDNB) 的反應 測序 與Edman試劑 (PITC 苯異硫氫酸酯) 測序-羧基參加的反應：1. 成鹽和成酯反應： 可用于羧基的保護。2. 成酰氯反應：可用于羧基的活化。3. 脫羧基反應：是生成胺類的重要反應。4. 疊氮反應：可用于羧基的活化。11、蛋白質功能的多樣性a) 催化：大多數酶是蛋白質。b) 調節：如激素和反式作用因子。c) 轉運：如血紅蛋白、血清蛋白、載酯蛋白、膜轉運蛋白等。d) 貯存：如種子蛋白和卵清蛋白。e) 運動：如肌肉、微管蛋白等。f) 結構成分：如角蛋白、膠原蛋白等。g) 支架作用：如錨定蛋白、連接蛋白等。h) 防御和進攻：如抗體、毒蛋白等。i) 特殊功能：如甜蛋白、膠質蛋白等。12、氨基酸組成的分析a) Edman化學降解法:用此原理已制成蛋白質序列分析儀。若每次循環的準確度為99%, 經60次循環，準確度為：0.9960=0.54b) 降解法：可用氨肽酶和羧肽酶，只能測出末端的幾個氨基酸。羧肽酶 Y 可作用于任何氨基酸，有可能以此為基礎開發出新的氨基酸的順序測定儀。c) 根據核苷酸序列推定法：分離mRNA，經反轉錄測定cDNA的核苷酸序列, 再用遺傳密碼推定氨基酸序列。d) 質譜法：可分析微量的肽鏈，短肽在第一臺質譜儀中經電噴射電離，按荷質比分離，依次在經碰撞池被裂解成離子碎片，在第二臺質譜儀中測出各個離子碎片的譜線，推算出短肽的氨基酸序列。在蛋白質組學中應用廣泛，但不能區分亮氨酸和異亮氨酸。13、為何要進行作圖分析1) 基因組計劃的基本目標是獲得全基因組順序，在此基礎之上再對所獲得的序列進行解讀。獲取基因組順序的主要方法是進行 DNA 測序，然后再將所獲取的順序進行組裝以得到完整的基因組序列。2) 基因組測序的第一步是構建基因組圖，然后將基因組區段分解后逐個測序，最后進行組裝。3) 基因組作圖的基本構想：在長鏈DNA分子的不同位置尋找特征性的分子標記，根據標記將包括這些序列的克隆進行連鎖定位，繪制基因組圖，該圖一旦構建好，即可著手進行全基因組測序。 14、以基因組作圖為指導的 2 種測序策略：1) 直接鳥槍法：首先進行全基因組鳥槍法測序，再以基因組圖的分子標記為起點將鳥槍法 DNA 片段進行組裝。高密度的基因組圖分子標記可以檢測組裝的 DNA 片段是否處在正確的位置，并校正因重復順序的干擾產生的序列誤排。這是一種由下至上(bottom to up) 的測序策略。2) 重疊群 (contig) 法：重疊群是指相互間存在重疊順序的一組克隆。根據重疊順序的相對位置將各個克隆首尾連接，覆蓋的物理長度可達Mbp。在單個的重疊群中，采用鳥槍法測序，然后在重疊群內組裝。這是一種從上至下 (up to down) 的測序策略。15、遺傳圖的繪制有性雜交實驗 根據需要有計劃地實施雜交方案而后進行連鎖分析，如果蠅、老鼠以及玉米、水稻等動植物的遺傳學實驗。系譜分析 不能進行有計劃的遺傳實驗，只能收集家系成員的相關資料進行連鎖分析，主要涉及人類以及多年生的樹木等。DNA轉移 不發生減數分裂的生物，如細菌與病毒基因組的連鎖分析。16、為什么要繪制物理圖？遺傳分析繪制的基因組圖為何不能指導基因組計劃的測序？遺傳圖的分辨率有限 這一點對微生物不成問題，因為微生物基因組較小，記錄成百上千次實驗就能獲得十分詳盡的遺傳圖，其標記分布密度僅為數千個核苷酸。而人類及大多數高等真核生物由于不可能獲得大量的后代，只有少數的減數分裂事件可供研究，連鎖分析的分辨力受到很大的限制。因而難以達到基因組測序對基因組圖的標記分辨率的要求。遺傳圖的精確性較低 由于重組熱點的存在使得染色體某一區段的交換頻率高于其他區段，尤其是倒位區段，由于受到交換限制，無法繪制精確的遺傳圖。由于存在以上兩個局限，因而在進行大規模的DNA測序之前，對大多數的真核生物的遺傳圖必須進行驗證并利用其他的作圖技術予以校正和補充。17、常用的物理作圖技術：限制性作圖 (restriction mapping): 將限制性酶切位點標定在 DNA 分子的相對位置。依靠克隆的基因組作圖 (clone-based mapping): 根據欲克隆的 DNA 片段之間的重疊順序構建重疊群(contig)，繪制物理連鎖圖。熒光標記原位雜交 (fluorescent in situ hybridization, FISH): 將熒光標記的探針與染色體雜交確定分子標記的所在位置。順序標簽位點 (sequence tagged site, STS): 通過PCR或分子雜交將小段 DNA 順序定位在基因組的DNA 區段中。18、脈沖場凝膠電泳PFGE, pulsed-field gel electrophoresis)：是一種分離大分子 DNA 的方法。在普通凝膠電泳中，大的 DNA 分子 (10kb) 移動速度接近，在凝膠中難以形成足以區分的條帶。在PFGE中，電場不斷在兩種方向上（有一定夾角，而不是相反的兩個方向）變動。DNA分子帶有負電荷，會朝正極移動，相對較小的分子在電場轉換后可較快轉變移動方向，而較大的分子轉向較為困難，因此小分子向前移動的速度比大分子快。PFGE可用來分離從 10kb10Mb 的 DNA 分子。19、常用的指紋分析方法：A 限制性帶型 (restriction patterns) 指紋 B 重復順序 DNA 指紋 (repetitive DNA fingerprints) C STS 目錄作圖 (STS content mapping) D 重復 DNA PCR (repetitive DNA PCR) 或分散重復順序 PCR (interspersed repeat element PCR, IRE- PCR) 指紋。20、STS作圖原理1) 序列標簽位點或 STS (sequence -tagged site, STS)是基因組中任何單拷貝長度在100500bp之間的DNA序列，與限制性核酸內切酶的識別序列相關聯，每個基因組中僅 1 份拷貝，很易分辨。2) 將染色體DNA隨機打斷，2個標記所處的物理位置越近，位于同一片段的機率越高3) 隨機打斷的染色體DNA長度不一，彼此靠近的2個標記有很大的機率位于同一片段，相距較遠的標記分開的機率很高。21、作為合格的STS必須要滿足2個條件： 它應是一段序列已知的片段，可據此設計PCR反應來檢測不同的DNA片段中是否存在這一順序； STS必須在染色體上有獨一無二的位置，如果某個STS在基因組中多個位點出現，則由此得出的作圖數據將是含混不清的。22、尋找STS的常用方法： 表達順序標簽 (expression sequence tag, EST) 這是一些從cDNA克隆中找到的小段序列。EST轉變成STS的條件是：這個EST來自單拷貝基因而非基因家族成員，后者常常含有相同或相似的序列。 簡單序列長度多態性 (simple sequence length polymorphism, SSLP) SSLP產生于重復順序的可變排列，同一位點重復順序的重復次數不同，表現出DNA序列的長度變化。與RFLP不同的是，SSLP具有多等位性(multiallelic)，每個SSLP都有多個長度不一的變異體。具有多態性并已在連鎖分析中定位的SSLP具有特別的價值，因其可直接建立遺傳圖與物理圖之間的聯系。 隨機基因組順序 從克隆的DNA中隨機測序可獲得有用的序列，也可從數據庫中尋找感興趣的某些序列。23、SAGE特點：1) 進行轉錄物組研究，也就是轉錄水平的研究；2) 通過快速和詳細分析成千上萬個EST來尋找出表達豐度不同的SAGE標簽序列，從而接近完整地獲得基因組的表達信息；3) SAGE區別于差異顯示、消減雜交等其它技術的主要特點是可用于尋找那些較低豐度的轉錄物，最大限度地收集基因組的基因表達信息，這使之成為從總體上全面研究基因表達、構建基因表達圖譜的首選策略；4) SAGE可用于在不同環境、不同生理狀態及不同生長階段的細胞和組織表達圖譜構建，對不同狀態下基因表達水平的定量或定性比較，特別是對疾病組織與正常組織的比較發展迅速。理論依據：1) 來自轉錄物內特定位置的一小段寡核苷酸序列 (9-11 bp) 含有鑒定一個轉錄物特異性的足夠信息，可作為區別轉錄物的標簽 (tag)；2) 通過簡單的方法將這些標簽串聯在一起，形成大量多聯體 (concatemer)，對每個克隆到載體的多聯體進行測序，并應用 SAGE 軟件分析，可確定表達的基因種類，并可根據標簽出現的頻率確定基因的表達風度 (abundance)。步驟：a) 將5g含有oligo dT(引物)的磁珠與RNA混合。b) 合成雙鏈cDNA。c) 用Nla酶消化形成一條鏈末端有標簽的產物。d) 將樣品分成兩份，連接成含有識別序列的產物，以備用BsmF1消化。e) 用Mme I切割每一個樣品形成約60bp的標簽。f) 延伸5秒，連接成約130bp的雙鏈標簽。g) PCR擴增。h) 用Nla 酶切130bp產物釋放34bp雙鏈標簽。i) 連接片斷形成串聯體。j) 克隆到pZErO-1+里，并測序。24、基因芯片的主要應用1) 基因表達檢測 擬南芥、酵母基因表達研究等；2) 突變檢測 BRCA基因外顯子、CFTR基因、-地中海貧血、酵母突變菌株、HIV-1逆轉錄酶及蛋白酶基因等的突變檢測等；3) 基因組多態性分析 人類基因組單核苷酸多態性的鑒定及分析及人線粒體 16.6kb 基因組多態性的研究等；4) 基因文庫作圖 通過確定重疊克隆的次序從而對酵母基因組進行作圖。25、生物大分子的制備的主要特點： 生物材料的組成極其復雜，常含有數百種乃至上千種化合物。 許多生物大分子在生物材料中的含量極微，分離純化步驟繁多、流程長。 許多生物大分子一旦離開了生物的體內環境就極易失活，因此在分離過程中如何防止其失活，就是生物大分子制備的最困難之處。 生物大分子中的各種具體物質的組成比例不同。 制備幾乎都是在溶液中進行的，溫度、pH值、離子強度等各種參數對溶液中各種組成的綜合影響，很難準確估計和判斷。26、生物大分子的制備步驟： 明確生物大分子制備的目的和要求； 建立相應可靠的分析測定方法； 通過文獻調研和預備性實驗； 生物大分子制備方案的選擇和探索； 生物材料的破碎和預處理； 目的產物的提取及進一步的分離純化； 生物大分子制備物的均一性（即純度）鑒定； 目的產物的濃縮、干燥 和 保存。27、生物大分子的分離純化方法可粗略地分類如下 以分子大小和形態差異為依據的方法：差速離心、區帶離心、超濾、透析和凝膠過濾等。 以溶解度差異為依據的方法：鹽析、萃取、分配層析、選擇性沉淀和結晶等。 以電荷差異為依據的方法：電泳、電滲析、等電點沉淀、吸附層析和離子交換層析等。 以生物學功能專一性為依據的方法：親和層析等。28、生物大分子樣品的早期分離純化：(1) 特點： 粗提取液中物質成份十分復雜； 欲制備的生物大分子濃度很稀； 物理化學性質相近的物質很多； 希望能除去大部分與目的產物的理化性質差異較大的雜質。(2) 對所選方法的要求： 要快速、粗放； 能較大地縮小體積； 分辨力不必太高； 負荷能力要大。(3) 可選用的方法：吸附；萃取；沉淀法（熱變性、鹽析、有機溶劑沉淀等）；離子交換（批量吸附、胖柱交換）；親和層析；29、生物大分子樣品的晚期分離純化：(1) 可選用的方法：吸附層析、鹽析、凝膠過濾、離子交換層析、親和層析、等電聚焦制備電泳、制備HPLC等。(2) 要注意的一些問題： 鹽析后要及時脫鹽。 用凝膠過濾時如何縮小上樣體積，因為凝膠層析柱的上樣體積只能是柱床體積的1/101/6，也可使用串聯柱以加大柱床體積。 必要時也可重復使用同一種分離純化方法，如分級有機溶劑沉淀、分級鹽析、連續兩次凝膠過濾、離子交換層析等。 分離純化步驟前后要有科學的安排和銜接，盡可能減少工序，提高效率。如吸附不可放在鹽析之后，以免大量鹽離子影響吸附效率；離子交換要放在凝膠過濾之前，因為離子交換層析的上樣量可以不受限制，只要不超過柱交換容量即可。 分離純化后期，目的產物的純度和濃度都大大提高，此時對于很多敏感的酶極易變性失活，因此操作步驟要連續、緊湊，盡可能在低溫下（如在冷室中）進行。 得到最終產品后，必要時要立即冰凍干燥，分裝并寫明標簽，-20或-70保存。30、蛋白質樣品制備原則與純化方法：原則：(1) 在適宜鹽濃度下，可重復溶解所有蛋白質，包括疏水性蛋白質，并使樣品中的分子以分離的形式存在；(2) 避免溶解性低的蛋白質（如胰蛋白）在等電聚焦時由于溶解度降低而沉淀析出；(3) 防止蛋白質的化學修飾，包括蛋白質降解、蛋白酶或尿素熱分解后所引起的修飾；(4) 排除核酸、多糖、脂類和其他干擾分子；(5) 獲得的目標蛋白質應在可探測水平，有時需要去除高豐度蛋白質和不相關蛋白質。純化方法：1) 沉淀法：有機溶劑沉淀法、選擇性沉淀法、等電點沉淀法、共沉淀法2) 根據形態差異建立的方法：透析、超濾、離心分析3) 依據電荷特性設計的分離方法：吸附交換分離法、聚焦層析、電泳法4) 根據穩定性建立的分離純化方法：熱變性法、酸堿變性法、表面變性法5) 根據親和作用建立的純化方法：親和電泳、免疫吸附層析、疏水作用層析 、共價層析 、金屬螯合層析 6) 高效液相色譜分離分析法：體積排阻色譜、離子交換色譜法、反相色譜法 、高效疏水作用色譜31、雙向凝膠電泳的基本原理雙向電泳的第一向是等電聚焦電泳，根據蛋白質的PI不同進行分離，第二向為變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，根據分子量不同進行分離，樣品經過電荷和質量兩次分離后，得到等電點和分子量的信息。32、雙向電泳的分類非變性2D-PAGE、非變性/SDS-2D-PAGE、非變性/還原/SDS-2D-PAGE、變性2D-PAGE33、雙向電泳分析中的樣品制備：1) 應使所有待分析的蛋白樣品全部處于溶解狀態（包括多數疏水性蛋白），且制備方法應具有可重現性。2) 防止樣品在聚焦時發生蛋白的聚集和沉淀。3) 防止在樣品制備過程中發生樣品的抽提后化學修飾（如酶性或化學性降解等）。4) 完全去除樣品中的核酸和某些干擾蛋白。5) 盡量去除起干擾作用的高豐度或無關蛋白，從而保證待研究蛋白的可檢測性。34、雙向凝膠電泳的基本流程？(1)等電聚焦：標記膠條樣品上樣及水化置于聚焦盤內設定IEF電泳程序加礦物油覆蓋膠面(2)膠條平衡：先在含有SDS、還原劑DTT但不含碘乙酰胺的平衡液中平衡，再在含碘乙酰胺的平衡液中平衡(3)SDS-PAGE：制膠樣品制備加緩沖液連接電源電泳(4)染色：染色液及脫色液的配制染色脫色35、雙向電泳中第一向到第二向進行平衡過程的機理？平衡buffer 1：還原(將SS鍵轉化為SH)，DTT平衡buffer 2：烷基化物 (使每個SH均烷基化以防止SS鍵的重新形成),碘乙酰胺36、有機染料和銀染1) 考染靈敏度為30100ng，線性范圍是20倍；銀染的線性范圍是40倍，靈敏度是考染的100倍。2) 膠體考馬斯亮藍染色技術可實現PAGE的無背景染色，其極限靈敏度為810ng，但這種染液會對蛋白質進行修飾而影響質譜分析的結果。3) 胺基黑常用于轉印至聚偏二氟乙烯 (PVDF) 和/或硝酸纖維素膜上的蛋白質的染色。4) 銀染的缺點是：對某些種類的蛋白質染色效果差，對其后的蛋白質測序和質譜分析造成影響。5) 這兩種染色技術都可減少膠內蛋白質產量。37、預防酶自解和微生物的污染： 使用較好的測序級TPCK-Trysin； 在加酶使膠塊吸脹后，一定要去掉多余的酶液，不要認為這樣會影響酶解效率； 酶解時間不宜過長，24hr； 電泳玻板、染膠的器皿等用前要清洗； 所用試劑和溶液的純度要高，以保證質譜分析的可靠性； 盡量用干凈的乳膠手套和潔凈的EP管及Milliq水； 盡量減少不必要的操作步驟，簡化操作程序； 要有一個潔凈的操作環境。38、膠內酶解注意事項： 若樣品種類較多，應將離心管編號，樣品對號入管； 考染方案各注釋均適用銀染方案； 整個操作過程應注意角蛋白等的污染； 佩戴一次性乳膠手套，使用潔凈的離心管及Millipore水； 不同公司的酶需要不同的最適的pH，因此，需調pH值。39、樣品的純化與濃縮： 操作步驟 配制適當的溶液 對不同質量范圍的蛋白質或肽段的提取效率應事先估計 注意事項： 整個操作過程潤濕體積0.6l（因填料為0.6l )； pH4； 整個過程不能引入氣泡； 注意流速，最好速度均勻。40、蛋白質定量分析策略41、定量蛋白質組學？內容：是把一個基因組表達的全部蛋白質或一個復雜的混合體系中所有的蛋白質進行精確的定量和鑒定的一門學科。通常情況是只需對兩種不同狀態細胞的蛋白質進行比較，只需相對含量的變化進行準確的定量即可。意義：研究方法：（1）體內標記： 15N體內代謝標記：用富含15N的介質來培養細胞，15N被滲入合成的蛋白質中，從而充當其定量的內部標準，每結合一個15N，該肽比正常14N的相同肽大一個質量單位，使得不同細胞狀態來源的肽段得以區分，肽質譜峰信號成對出現，從而根據質譜峰的信號強度來進行準確的定量。L 缺點：由于相同肽段的不同同位素標記形式之間的質量變化依賴于氮原子數目，因此對未知蛋白難以進行定量。 穩定同位素標記的必需氨基酸標記：在培養介質中加入穩定同位素標記的必需氨基酸，如Lys、Leu、Phe等。這主要用于高等動物細胞中蛋白質的定量以及鑒定。優點：省去了標記化學反應和分離純化等步驟，因而減少了樣品的損失，有利于低豐度蛋白質的高靈敏度檢測。缺點：1.不能對組織來源的蛋白質進行分析。2.同位素介質可能會影響蛋白質的表達水平。3.受成本限制，不能對整個動物體進行標記。4.無法確定標記物與肽段之間量的關系。(2)同位素親和標簽技術ICATICAT試劑包括三部分：1.反應基團，可特異地與蛋白質側鏈上的半胱氨酸（Cys）殘基的-SH進行反應，使試劑共價結合在蛋白質側鏈上；2.同位素標記的接頭，含有穩定同位素（H和D）的標記；3.親和標記的生物素，用于分離標記的蛋白質或多肽。 ICAT試劑中8個X位置被H取代時，稱為輕試劑（D0），8個X位置被D取代時，稱為重試劑（D8）。輕試劑和重試劑的相對分子量差8Da或4Da（肽段帶兩個電荷） 在質譜圖上這對標記蛋白質的肽段離子峰m/z 相差8或4，從而能將來自不同樣品的同一蛋白質分離開。ICAT策略的優點:：a) 若一種蛋白質酶切產生至少一個Cys殘基的肽段的話，就可以對其進行鑒別和定量。含有Cys殘基的肽段越多，結果對照得出的結論就越準確；b) 鑒定的肽段中肯定都會有至少一個Cys，因此在進行數據庫搜索時就增加了一個有效的約束條件；c) 肽段根據標記情況有選擇性地得到了富集，從而減少了下游質譜分析的復雜程度；d) 分離出來的標記多肽可直接與后面的RP-LC-MS分析系統在線偶聯操作；e) 可直接對混合樣品進行分析；f) 可對低豐度蛋白質直接捕獲和快速定性、定量鑒定，尤其是對膜蛋白等疏水性蛋白質；g) 可快速找出功能性蛋白質；h) 無需繁冗的雙向凝膠電泳分析分離；i) ICAT軟件及質譜技術平臺系統可用于全自動快速鑒定蛋白質。ICAT策略的缺陷：a) 不能獲得不含Cys的肽段，同時翻譯后修飾的檢出率較低，而酵母細胞中約有10%左右的蛋白質肽鏈上沒有Cys殘基，因而得不到鑒定；b) ICAT試劑的分子質量為500Da左右，相對肽段而言較大，增加了數據庫檢索算法的復雜性，對于較小片段的修飾可能會影響數據庫搜索；c) 耗時太長，數據存儲消耗在表達量沒有改變的蛋白質上，而這些蛋白質可能與研究的問題沒有太大的關聯；d) 相對于雙向凝膠電泳技術，該方法有高分子量偏性。ICAT策略的改進措施：a) 采用了固相氨基酸同位素標記試劑來代替ICAT試劑；b) 采用多維LC-MS/MS分析系統，把鑒定和定量分開；c) 雙向凝膠電泳技術與ICAT技術互補結合測定蛋白質在兩樣品中的相對含量 d) 磷酸化蛋白質同位素標記親和標簽(Phosphoprotein isotope-coded Affinity Tags, PhIAT) 技術。42、同位素親和標簽（ICAT）標記方法的步驟:：a) 將來自一種狀態下的細胞的蛋白質混合物分離純化后用D0試劑標記蛋白質側鏈上的Cys殘基；將來自另一狀態下的同種細胞的蛋白質混合物分離純化后用D8試劑標記；b) 將兩種樣品混合在一起，用trypsin酶切，產生多肽片段，包括標記的和未標記的；c) 樣品經SCX-RPLC兩維色譜分離，除去消化酶、去垢劑、還原劑和ICAT試劑；d) 混合物經過抗生物素和色譜柱分離，得到只含有同位素標記的多肽混合物；e) 將分離得到的標記多肽混合物再用RP-lC-MS分離和鑒定。43、不同染色方法的比較：1) 考馬斯亮藍：優點：選擇性地對蛋白質進行染色，大大地降低了化學噪音，提高了靈敏度2) 銀染：優點：大大提高了靈敏度；擴展了動態線性范圍兼容質譜（去除戊二醛后）；快速，方便3) 缺點：銀離子可與半胱氨酸殘基結合；銀染試劑戊二醛和甲醛都會對蛋白質的-和-氨基烷基化，妨礙后續分析4) 熒光染色：優：與質譜兼容性好，在2-2000ng間效果與量成線性正比5) 缺：范圍窄、試劑貴、需要較高的設備44、亞細胞蛋白質組的研究意義和策略：意義：富集低豐度蛋白、對特定成份的蛋白質的研究，提供亞細胞定位信息、提供結構與功能的信息、對細胞分子的生理分子預測、差異表達譜策略：亞細胞組分的分離、亞細胞蛋白質組學技術、蛋白質亞細胞定位技術、蛋白質亞細胞定位預測技術定位實驗技術：分離、TAP（串聯親和純化）、免疫電阱或免疫熒光-確認、轉基因（GFP）、基因缺失突變45、蛋白質相互作用和研究策略？作用： 多亞基蛋白質的形成； 多成分蛋白質的相互作用； 瞬時的蛋白質相互作用，控制著一些重要的生命活動。研究方法：生化方法：親和層析、親和印跡、免疫共沉淀、化學交聯、熒光共振能量轉移、生物傳感器分子生物學方法：酵母雙雜交系統、噬菌體展示技術、串聯親和純化技術（TAP）遺傳學方法：基因外抑制子、合成致死46、熒光共振能量轉移原理：是指在兩個不同的熒光基團中，如果一個熒光基團（供體 Donor）的發射光譜與另一個基 團（受體 Acceptor）的吸收光譜有一定的重疊，當這兩個熒光基團間的距離合適時（一般小于100），就可觀察到熒光能量由供體向受體轉移的現象，即以前一種基團的激發波長激發時，可觀察到后一個基團發射的熒光47、噬菌體展示技術：是一種基因表達產物和親和選擇相結合的技術，他以改構的噬菌體為載體，把待選基因片段定向插入噬菌體外殼蛋白質基因區，使外源多肽或蛋白質表達并展示于噬菌體表面，進而通過親和富集法表達有特異肽或蛋白質的噬菌體48、生物傳感器 (biosensor)由固定化的生物敏感材料作識別元件與適當的理化換能器及信號放大裝置構成的分析工具或系統。特點：(1) 采用固定化生物活性物質作催化劑；價值昂貴的試劑可多次重復使用，克服了過去酶法分析試劑費用高和化學分析繁瑣復雜的缺點；(2) 專一性強，只對特定的底物起反應，而且不受顏色、濁度的影響；(3) 分析速度快，可以在一分鐘得到結果；(4) 準確度高，一般相對誤差可以達到1；(5) 操作系統比較簡單，容易實現自動分析；(6) 成本低，在連續使用時，每例測定僅需要幾分錢人民幣；(7) 有的生物傳感器能可靠地指示微生物培養系統內的供氧狀況和副產物的產生，能得到許多復雜的物理化學傳感器綜合作用才能獲得的信息，同時還可指明增加產物得率的方向。49、質譜原理特點及質譜系統？MS原理：待測化合物分子吸收能量（在離子源的電離室中）后產生電離，生成分子離子，分子離子由于具有較高的能量，會進一步按化合物自身特有的碎裂規律分裂，生成一系列確定組成的碎片離子，將所有不同質量的離子和各離子的多少按質荷比記錄下來，就得到一張質譜圖。由于在相同實驗條件下每種化合物都有其確定的質譜圖，因此將所得譜圖與已知譜圖對照，就可確定待測化合物。特點： 信息量大，應用范圍廣，是研究分子結構的有力工具。 由于分子離子峰可以提供樣品分子的相對分子量的信息，所以質譜法也是測定分子量的常用方法。 分析速度快、靈敏度高、高分辨率的質譜儀可以提供分子或離子的精密測定。 質譜儀器較為精密，價格昂貴，工作環境要求較高。 系統：質譜儀結構由7部分組成：進樣系統、離子源室、質量分析器、檢測器、數據處理系統、真空系統和供電系統。其中離子源室、質量分析器、檢測器必須處于高真空狀態，離子源要求10-410-5Pa, 質量分析器要求10-6Pa，以降低背景以及減少離子間或離子與分子的碰撞。進樣系統：把樣品從室內常壓轉移到離子源。離子源室：把樣品分子轉換成樣品離子。在質量分析器里：電場或者磁場，或者兩者都有的分析器，被用來控制樣品離子的運動，這樣便可根據其質量不同而將其分離。檢測器:可以感知已經被分離的離子的到達，放大極其微小的離子的電流以便進一步的電子處理。記錄儀接受檢測器的信號，將其放大并記錄，這樣就得到了質譜圖。質譜要在真空系統運行減少空氣中成分的干擾，離子源，質量分析器和檢測器在真空系統里。 50、四級桿質譜與飛行時間質譜？四級桿質譜：物質氣化后以分子狀態進入質譜儀后，經過燈絲發射的電子轟擊后，成各種不同的碎片，有的是只掉了一個H，有的是掉了一個基團，有的成為更小的碎片，各種各樣的，然后這些碎片進入四極桿后，四極桿通過不同的電的方向變換，這些碎片在通過四極桿時，由于碎片的質量和所帶的電核不同（質荷比）所以，也隨著四極桿電的方向變換而改變前進方向，帶電碎片到達終點（接收端）的時間不同，質荷比太小或太大的帶電碎片它們的方向變換也會過快或過慢（這個可以設置）會撞到四極桿而不能被檢測，中間的碎片會按質荷比由小到大的順序先后到達接受端，而被檢測到。飛行時間質譜：TOF-MS分析方法的原理非常簡單。這種質譜儀的質量分析器是一個離子漂移管。樣品在離子源中離子化后即被電場加速，由離子源產生的離子加速后進入無場漂移管，并以恒定速度飛向離子接收器，假設離子在電場方向上初始位移和初速度都為零，所帶電荷數為q，質量數為m, 加速電場的電勢差為V, 則加速后其動能應為： m v2 / 2= qe V其中，v 為離子在電場方向上的速度。離子以此速度穿過負極板上的柵條，飛向檢測器。離子從負極板到達檢測器的飛行時間t，就是TOFMS 進行質量分析的判據。51、生物質譜的基本原理？分析樣品在特定的條件下轉變為高速運動的離子，這些離子根據質量/電荷比的不同在靜電場和磁場的作用下得到分離，用特定的檢測器可以記錄不同質荷比的各種離子的相對強度并形成質譜圖。主要部分組成？基本部分：（1）離子源（2）質量分析器（3）檢測器，檢測由質量分析器分離的離子其他部分：（1）復雜計算機 （2）真空泵系統主要類型：52、生物質譜的電離方式？硬電離方法：能給樣品較大能量、生成較多碎片離子的電離方法電子轟擊離子化、EI軟電離方法：給樣品較小能量、碎片離子較少或不生成碎片離子的電離方法電噴霧電離(ESI)、基質輔助激光解吸電離(MALDI)53、ESI和MALDI的比較離子化方式 可在線聯用的方式 離子電荷形式 對雜質容忍程度 ESI 液相 多電荷 直接進樣時差 MALDI 固相 一般為1或2個電荷 較好54、比較MALDI和ESI的異同點？MALDI離子源工作原理：(1)以脈沖方式使樣品離子化，從固相標本中產生的離子，并在飛行管中測定分子量(2)將分析物分散在基質分子（尼古丁酸及其同系物）中并形成晶體，用激光照射晶體，由于基質分子經輻射所吸收的能量導致能量蓄積并迅速產熱，從而使基質晶體升華，導致基質和分析物膨脹并進入氣相(3)樣品被包裹在基質中，大部分激光能量被基質的發色基團首先吸收，從而保護了樣品分子的完整性MALDI優點：能夠耐受高鹽；具有較高的質測上限；能分析混合物；敏感度為fmol；可發展為蛋白及核酸測序手段缺點：質量分辨率500*；質量測定精確度為 0.1% 0.01%；不能與液相色譜聯用ESI離子源工作原理：原理：樣品通過液流流動（通常從HPLC）進入離子源，穿過有持續高壓的不銹鋼錐體或進樣針，隨著液流利開進樣針樣品分散為細霧狀微滴。微滴含有肽離子以及HPLC流動相組分（水、乙腈、醋酸等）。離子源進一步從溶液組分中分離肽離子，將離子轉移到質量分析器。ESI優點：能與HPLC、CZE聯用；能形成多價離子，可更為準確地測定分子量；質量分辨率為2000以上*；可以直接從水相觀察非共價復合物；敏感度為fmol pmol；質量測定精確度為0.01%缺點：在分析混合物時，多價離子形成會使結果分析比較困難；僅在低鹽（1mmol/L）條件下給出理想信號；樣品組成過于復雜時可能不產生信號信號55、什么是串聯質譜？碰撞誘導解離？串聯質譜：兩個或更多的質譜連接在一起稱為串聯質譜，最簡單的是由兩個質譜串聯而成，其中第一個質量分析器將離子預分離或加能量修飾，由第二級質量分析器分析結果。常見的有串聯四級桿質譜、四級桿離子阱質譜等。作用：1、誘導第一級質譜產生的分子離子裂解，有利于研究子離子和母離子的關系，進而給出該分子離子的結構信息。2、從干擾嚴重的質譜中抽取有用數據，大大提高質譜檢測的選擇性，從而能夠測定混合物中的痕量物質。碰撞誘導解離：CID碰撞活化解離在碰撞室內進行，帶有一定能量的離子進入碰撞室后，與室內情性氣體的分子或原子發生碰撞，離子發生碎裂。為了使離子碰撞碎裂，必須使離子具有一定動能，對于磁式質譜儀，離子加速電壓可以超過1000