免疫學檢測法免疫學檢測技術的用途非常廣泛，它們可用于有關免疫疾病的診療、療效評價及發病機制的研究。如對傳染病、免疫增殖性疾病、免疫缺損病、超敏反映、本身免疫病、移植排斥反映腫瘤的免疫學檢測，對診療、治療都有很大協助。另外在醫學生物學研究中對抗原性物質或細胞的定性、定量檢查不僅推動了對多個免疫學現象的研究，并且擴大免疫學與醫學生物許多領域的聯系。本章僅介紹慣用免疫學檢測辦法的原理，簡要過程和實用意義。第一節抗原或抗體的檢測一、檢測的原理借助抗原和抗體在體外特異結合后出現的多個現象，對樣品中的抗原或抗體進行定性、定量、定位的檢測。1．抗原與抗體的親和力(affinity)抗原抗體的結合就像酶與底物的結合，激素與其受體的結合同樣不是化學的反映，而是非共價鍵的可逆的結合。抗原決定簇和抗體分子可變區互補構型，造成兩分子間有較強的親和力。空間構型互補程度不同，抗原和抗體分子之間結合力強弱也不同。互補程度高，則親和力強。另外，反映溫度、酸堿度和離子濃度對抗原和抗體分子上各基因的解離性和電荷特性也有重要的影響，抗體與抗原決定簇之間的結合力大小可用親合力來表達。高親合力的抗體與抗原的結合力強，即使抗原濃度很低時也有較多的抗體結合抗原形成免疫復合物。2．抗原或抗體外檢測原理根據抗原抗體結合形成免疫復合物的性狀與活性特點，對標本中的抗原或抗體進行定性、定位或定量的檢測。定性和定位檢測比較簡樸，即用已知的抗體和待檢樣品混合，通過一段時間，若有免疫復合物形成的現象發生，就闡明待檢樣品中有對應的抗原存在。若無預期的現象發生，則闡明樣品中無對應的抗原存在。同理也可用已知的抗原檢測樣品中與否有對應抗體。對抗原或抗體進行定量檢測時，以反映中加入抗原和抗體的濃度與形成免疫復物的濃度呈函數關系。（1）根據免疫復合物產生的多少來推算樣品中抗原（或抗體）的含量：在一定的反映條件下，加入的已知抗體（或抗原）的濃度一定，反映產生的免疫復合物多少與待檢樣品中含有對應抗原（或抗體）量成正比。也就是抗體濃度一定時，免疫復合物越多則樣品中的抗原量也越多。可用實驗性原則曲線推算出樣品中抗原（或抗體）的含量。如免疫單向擴散實驗、免疫比濁實驗和酶聯免疫檢測等都屬于類辦法。（2）抗原或抗體效價滴定的原理：當抗原抗體復合物形成多少不能反映抗原抗體反映強弱時，就不能以檢測反映強度來對抗原或抗體進行定量。在實際工作中，把濃度低的反映成分（抗原或抗體）的濃度固定，把濃度高的另反映成分作一系列稀釋。例如用人血清作抗原免疫3只家兔，比較3只家兔產生抗體的多少，即滴定3只兔血清抗體效價，可用雙向瓊脂擴散法來滴定，例如將抗體濃度固定，將抗原作不同的稀釋度，分別將抗原或抗體滴入瓊脂的對應小孔中，觀察免疫兔血清與不同稀釋度的抗原出現明顯沉淀淺的抗原稀釋度（如甲兔的抗體效價為1/，而丙免的是1/8000則可比較出后者比前者產生抗體的效價要高）。也就是表達效價的稀釋度越高，樣品中所含待檢成分越多。因人血清（抗原）和抗體（免疫兔血清）相比，濃度高，故應稀釋抗原。二、抗原或抗體檢測的實用意義1．抗體檢測的意義檢測抗體可用于評價人和動物免疫功效的指標。抗體用于臨床治療或實驗研究時也需做純度分析和定量測定。臨床上檢測病人的抗病原生物的抗體、抗過敏原的抗體、抗HLA抗原的抗體、血型抗體及多個本身抗體，對有關疾病的診療有重要意義。2．抗原檢測的意義可做為抗原進行檢測的物質可下列四類：（1）多個微生物及其大分子產物：用于傳染病診療、微生物的分類及鑒定以及對菌苗、疫苗的研究。（2）生物體內多個大分子物質：涉及多個血清蛋白（如各類免疫球蛋白、補體的多個成分）、可溶性血型物質、多肽類激素、細胞因子及癌胚抗原等均可做為抗原進行檢測。在對這些成分的生物學作用的研究以及多個疾病的診療有重要意義。（3）人和動物細胞的表面分子：涉及細胞表面多個分化抗原（如CD抗原）、同種異型抗原（血型抗原或MHC抗原）、病毒有關抗原和腫瘤有關性情抗原等。檢測這些抗原對多個細胞的分類、分化過程及功效研究、對多個與免疫有關的疾病的診療及發病機制的研究，都有重要意義。（4）多個半抗原物質：某些藥品、激素和炎癥介質等屬于小分子的半抗原，能夠分別將它們偶聯到大分子的載體上，構成人工結合的完全抗原。用其免疫動物，制備出多個半抗原的抗體，應用于多個半抗原物質的檢測，例如對某些病人在服用藥品后進行血中藥物濃度的監測。對運動員進行服用違禁藥品的檢測，都是應用半抗原檢測的辦法。三、抗原或抗體檢測的辦法由于多個檢測辦法中所用的抗原性狀不同，出現成果的現象也不同。最廣泛應用辦法有下述幾個：（一）沉淀反映可溶性抗原與抗體結合，在兩者比例適宜時，可形成較大的不溶性免疫復合物。在反映體系中出現不透明的沉淀物，這種抗原抗體反映稱為沉淀反映（precipitationneaction）。1．環狀沉淀實驗先將含抗體的未稀釋的免疫血清加到直徑不大于0.5cm的小試管底部。將稀釋的含有可溶性抗原的材料重疊于上，讓抗原與抗體在兩液體的界面相遇，形成白色免疫復合物沉淀環，故名為環狀沉淀實驗（ringprecipitationtest）,此法簡便易行，需用材料較多是其缺點。2．單向免疫擴散實驗單向免疫擴散實驗（singleimmunodiffusion）是在凝膠中進行的沉淀反映。將抗體混入加熱溶解的瓊脂中，傾注于玻片上，制成含有抗體的瓊脂板，在適宜位置打孔，將抗原材料加入瓊脂板的小孔內，讓抗原從小孔向四周的瓊脂中擴散，與瓊脂中的抗體相遇形成免疫復合物。當復合物體積增加到一定程度時停止擴散，出現以小孔為中心的圓形沉淀圈，沉淀圈的直徑與加入的抗原濃度成正有關。本辦法簡便，易于觀察成果，可測定抗原的敏捷度（最低濃度）約為10～20μg/ml，慣用于定量測定人或動物血清IgG、IgM、IgA和C3等，其缺點是需1～2天才干當作果（圖20-1）圖20-1單向免疫擴散實驗示意圖3．免疫比濁法當抗體濃度高，加入少量可溶性抗原，即可形成某些肉眼看不見的小免疫復合物，它可使通過液體的光束發生散射，隨著加入抗原增多，形成的免疫復合物也增多，光散射現象也對應加強。免疫比濁法（immunonephelomytry）就是在一定的抗體濃度下，加入一定體積的樣品，通過一段時間，用光散射濁度計（nephelometry）測量反映液體的濁度，來推算樣品中的抗原含量。本法敏感、快速簡便，可取代單向擴散法定量測定免疫球蛋白的濃度。4，雙向免疫擴散實驗雙免疫擴散實驗（doubleimmunodiffusion）是在瓊脂板上按一定距離打數小孔，在相鄰的兩孔內分別放入抗原和抗體材料。當抗原和抗體向四周凝膠中擴散，在兩孔間可出現2～3條沉淀線，本法慣用于抗原或抗體的定性或定量檢測，或用于兩種抗原材料的抗原有關性分析（圖20-2）。圖20-2雙向免疫擴散實驗示意圖5．對流免疫電泳對流電泳（counterimmunoelectrophoresis）是一敏感快速的檢測辦法，即在電場作用下的雙向免疫擴散。將瓊脂板放入電泳槽內，使瓊脂板的兩孔沿著電場的方向，于負極側的孔內加入抗原，于正極側的孔內加入抗體，通電后，抗原帶負電荷向正極泳動，抗體分子雖也帶負電荷，但因分子量大，向正極的位移小，而受瓊脂中電滲作用向負極移動，抗原和抗體能較快地集中在兩孔之間的瓊脂中形成免疫復合物的沉淀線。只需1小時左右即可觀察成果。6．免疫電泳免疫電泳(immunoelectrophoresis)的辦法分成兩個環節，即先進行電泳，再進行瓊脂擴散。先將樣品加入瓊脂中電泳，將抗原各成分依電泳速度不同而分散開。然后在適宜的位置上沿電泳方向挖始終線形槽，于槽內加入含有針對多個抗原混合抗體液，讓各抗原成分與對應抗體進行雙向免疫擴散，可形成多答卷沉淀線。慣用此法進行血清的蛋白種類分析。對于免疫球蛋白缺損或增多的疾病的診療或鑒別診療有重要意義（圖20-3）。

圖20-3免疫電泳法基本步示決圖7．免疫印跡法免疫印跡法（immunoblotting）又稱為Western印跡法，用于AIDS的血清抗體檢測。第一步，為電泳分離HIV抗原，在電場中根據分子量大小不同病毒抗原各成分散開。第二步，將電泳分離的蛋白質轉移到硝酸纖維膜上（電印跡），然后將印跡有病毒抗原的硝酸纖維膜浸濕于病人血清中。如果病人血清中含有與一種或幾個抗原相對應的抗體的話，則在該抗原印跡部位形成免疫復合物沉淀。在洗去未沉淀的抗原和抗體后，在膜上加標記的抗人免疫球蛋白的抗體，此抗體能夠和病毒抗原與人抗體形成的免疫復合物發生反映，最后加入顯色底物（如果抗人Ig是用酶標記的）或做放射自顯影（抗人Ig用125Ⅰ標記）以顯示成果（圖20-4）。

圖20-4用免疫印跡法檢查血清中的HIV病毒抗體第一步：經電泳將HIV混合抗合抗原按分子量大小分離；第二步：將已分離的抗原經電印跡轉移到硝酸纖維膜上；第三步：將待檢病人血清加入覆蓋于硝酸纖維膜上；第四步：加入標記的第二抗體使之覆蓋膜上；第五步：加入顯色底物（或放射自顯影）顯現第二抗體（二）凝集反映細菌、紅細胞或表面帶有抗原的乳膠顆粒等都是不溶性的顆粒抗原，當與對應抗體結合，抗原與抗體結合形成凝集團塊，即稱為凝集反映（agglutination）。1．直接凝集直接凝集（directagglutination）是將細菌或紅細胞與對應抗體結合產生的細菌凝集或紅細胞凝集現象。可用于傳染病診療如肥達氏反映（Widalreaction）診療傷寒病。或運用血細胞凝集現象檢查血型。2．間接凝集間接凝集（indirectagglutination）是用可溶性抗原包被在乳膠顆粒或紅細胞表面，與對應抗體混合出現的凝集現象。如用γ球蛋白包乳膠顆粒檢測類風濕關節炎病人血清中的類風濕因子，用甲狀腺球蛋白包被乳膠顆粒用于檢測甲狀腺球蛋的抗體。也能夠將抗體吸附到乳膠顆粒上檢查臨床標本中的抗原，如細菌或真菌性腦膜炎抗體包被的乳顆粒，一旦與含有對應抗原的腦脊液混合，便可發生凝集，可進行快速診療。故凝集反映即可測定抗原，也可測抗體，辦法簡便、敏感。3．抗球蛋白實驗抗球蛋白實驗（antiglobulintest,coombstest）的原理為間接凝集實驗。例如應用于診療本身免疫溶血性貧血癥時，Rh+紅細胞與抗Rh血清間的反映。因抗Rh抗體是IgG只有兩個結合價，分子較小（不如IgM結合價多，分子大）很難直接引發Rh+紅細胞凝集。如果加入抗IgG的抗體，就可協助抗Rh的IgG的抗體凝集紅細胞。也就是經抗Ig的作用提高凝集反映的敏捷度。（三）補體參加抗原抗體反映這一類反映重要涉及溶血反映（hemolyticassay）、補體介導的細胞毒實驗（complementmediatedcytotoxicutytest）及補體結合實驗（complementfixationtest）。1．溶血反映抗體與紅細胞表面抗原相遇，形成紅細胞-抗體復合物即可使加入反映中的補體活化，造成紅細胞溶解，此辦法可用于紅細胞的多個抗原或對應抗體的檢測，此法比凝集反映敏感。溶血反映也是用于抗體分泌細胞即空斑形成細胞（PFC）檢測的原理。2．補體介導的細胞毒實驗多個有核細胞與針對其表面抗原的抗體相遇，所形成的免疫復合物能活化反映中的補體，引發細胞膜穿孔，在一定時間內，細胞仍能維持一定的形態不破碎，加入水溶性染如伊紅Y（eosinY）或臺盼藍（trypanblue）后，染料即可進入被活化補體穿孔的細胞，不帶對應抗原細胞膜保持完整的活細胞不著色。此辦法可用于帶多個抗原的細胞的檢測，如進行細胞MHC抗原的鑒定，和進行淋巴細胞中T細胞總數或其亞類的計數。在某些免疫學實驗中也可用這種辦法，根據需要特異地消除帶某種抗原的細胞。3．補體結合實驗當抗原（可溶性或顆粒性）與對應抗體結合，由于濃度低不出現可見反映時，應用補體結合實驗可檢出此抗原抗體反映，它比凝集反映或沉淀反映敏捷度高。本法涉及兩個抗原抗體系統。一為檢測系統由待檢樣品與已知抗原（或抗體）構成；另一為批示系統，由綿羊紅細胞（SRBC）和抗SRBC構成。另加入作為補體的新鮮豚鼠血清。實驗時試管中先加入檢測系統和補體，混合經37℃30分鐘使抗原、抗體、補體形成復合物，再加入批示系統，如出現溶血現象，闡明檢測系統中沒有相對應的抗原抗體，補體是游離的批示系統的SRBC和抗體結合而出現溶血，即為反映陰性。如不出現溶血，表明檢測系統中有抗原抗體復合物并結合補體，則批示系統無多出的補體作用而沒有溶血現象，即為陽性。在敏感的抗原、抗體檢測辦法（如酶標辦法）出現之前補體結合實驗曾廣泛用于檢測多個細菌、病毒或螺旋體（如梅毒）的抗原或抗體，由于本實驗影響因素多，成果不穩定現已被新檢測辦法所替代。四、用標記抗體或抗原進行的抗原、抗體反映用熒光素、同位素或酶標記抗體或抗原，用于抗原或抗體檢測是廣泛應用的敏感、可靠的辦法。上述三種慣用的標記物與抗原或抗體化學連接之后不變化后者的免疫特性。本辦法可用于定性、定量或定位檢測。1．免疫熒光技術免疫熒光技術（immunofluorescencetechni）是用化學辦法使熒光素標記的抗體（或抗原）與組織或細胞中的對應抗原（或抗體）結合，進行定性定位檢查抗原或抗體的辦法。（1）直接熒光法：把熒光抗體加到待檢的細胞懸液，細胞涂片或組織切片上進行染色，經抗原抗體反映后，洗去未結合的熒光抗體，將待檢標本在熒光顯微鏡下觀察，有熒光的部位即有對應抗原存在，此法可用于病毒感染細胞、帶某種特異抗原的細胞（如T細胞和B細胞）或病原菌的檢查，也可用于組織中從容的免疫復合物的檢查。本法的缺點是檢查多個抗原，就需分別制備對應的多個標記抗體。（2）間接熒光法：可克服直接法需制備多個熒光抗體的復雜操作。將組織或細胞上的抗原直接與對應抗體（不標記熒光）結合，此為第一抗體，再把能與第一抗體特異結合的熒光標記的抗免疫球蛋白抗體加入，此為熒光標記的第二抗體，觀察成果與直接法相似。間接法比直接法敏感性高，如果用于檢查抗原的第一抗體是人或動物的只需制備一種抗人或動物的免疫球蛋白熒光抗體（圖20-5）。圖20-5免疫熒光直接法及間接法原理示意圖免疫熒光技術在傳染病診療上有廣泛的用途，如在細菌、病毒、螺旋體感染的疾病，檢查抗原或抗體，如查出IgM抗體，可做為近期接觸抗原的標志，因此使用熒光標記抗IgM可診療近期感染。除微生物學方面的應用外，還可運用單克隆抗體鑒定淋巴細胞的亞類。使用流式細胞儀(fluorescene-activatedcellsorting,FACS)，能自動檢測細胞的大小、熒光強度。針對細胞表面不同抗原，能夠使用兩種不同的熒光染料，如用異硫氰熒光素（FITC）發黃綠熒光，用羅丹明（TMRITC）發紅色熒光。由于熒光顏色不同標記兩種不同的抗體，對同一細胞進行雙標記染色。對淋巴細胞亞類鑒定起著巨大推動作用。應用間接熒光法也用于本身免疫病的抗核抗體檢查。2．放射免疫分析法放射免疫分析法（radioimmunoassayRIA）應用競爭性結合的原理，應作放射性同素標記抗原（或抗體）與對應抗體（或抗原）結合，通過測定抗原抗體結合物的放射活性判斷成果，本辦法可進行超微量分析，敏感性高，可用于測定抗原、抗體、抗原抗體復合物。本法慣用的同位素有125Ⅰ和131Ⅰ。放射免疫分析慣用的有液相法和固相法兩種：（1）液相法：將待檢標本（例如含胰島素抗原）與定時的同位素標記的胰島素（抗原）和定時的抗胰島素抗體混合，經一定作用時間后，分離收集抗原抗體復合物及游離的抗原，測定這兩部分的放射活性，計算結合率。在反映系統中，待檢標本的胰島素抗原與同位素標記的胰島素競爭奪戰性與胰島素抗體結合。非標記的抗原越多，標記抗原與抗體形成的復合物越少。非標記抗原含量與標記抗原抗體復合物的量呈一定的函數關系。預先用原則的非標記抗原作成原則曲線后，即可查出待檢標本中胰島素的含量（圖20-6）。圖20-6液相放射免疫分析法原理及原則曲線（2）固相法：將抗原或抗體吸附到固相載體表面，然后加待檢標本，最后加標記抗體。測定固相載體的放射活性，慣用的固相載體有溴化氰（CNBr）海豹化的紙片或聚苯乙烯小管（圖20-7）。圖20-7固相放射免疫分析法原理放射免疫分析法應用范疇廣泛，涉及多個激素（胰島素、生長激素、甲狀腺素等）維生素、藥品、IgE等。3．酶聯免疫分析法酶聯免疫分析法（enzymeimmunoassay,EIA）是現在應用最廣泛的免疫檢測辦法。本法將抗原抗體反映的特異性與酶對底物高效催化作用結合起來，根據酶作用底物后顯色，以顏色變化判斷實驗成果，可經酶標測定儀作定量分析，敏感度可達ng水平。慣用于標記的酶有辣根過氧化物酶(horseradishperoxidase)、堿性磷酶（alkalinephosphatase）等。它們與抗體結合不影響抗體活性。這些酶含有一定的穩定性，制成酶標抗體可保存較長時間。現在慣用的辦法有酶標免疫組化法和酶聯免疫吸附法。前者測定細胞表面抗原或組織內的抗原；后者重要測定可溶性抗原或抗體。本法既沒有放射性污染又不需昂貴的測試儀器，因此較放射免疫分析法易推廣。圖20-8生物素－酶標親合素系統反映示意圖（1）酶聯免疫吸附實驗（enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA）:是與上述固相R