液相色譜串聯質譜法同時測定牛奶中4種代謝產物多殘留

1cs殘留檢測方法四環素（ts）是一種廣泛用于預防和治療家禽疾病的藥物。但由于該類藥物的使用不合理及濫用,容易誘導耐藥菌株和導致在食品及牛奶中四環素類藥物的殘留問題。歐盟及我國均規定牛奶中四環素類抗生素的最大殘留限量為0.1mg/kg。常用的TCs有:四環素(tetracycline,TC)、金霉素(chlortetracycline,CTC)、土霉素(oxytetracycline,OTC)、強力霉素(doxycycline,DC)、去甲基金霉素(demeclocycline,DMCTC)、甲烯土霉素(methacycline,MTC)和二甲胺四環素(minocycline,MINO)等。另外,四環素、金霉素和土霉素還可在動物體內經代謝而轉化為差向四環素(4-Epitetracycline,ETC)、差向金霉素(4-epichlortetracycline,ECTC)和差向土霉素(4-epioxytetracycline,EOTC),差向四環素類藥物的藥效極低或消失,但它們的毒副作用增加,已經被歐盟確定為四環素、金霉素和土霉素的殘留標識物。目前,TCs殘留的測定方法主要有微生物法、酶聯免疫法、薄層色譜法和液相色譜法,但這些方法存在特異性差的缺點。液質聯用法由于具有特異性強和靈敏度高的特點,可用于四環素類抗生素殘留的確證分析。但當前國內外對四環素類多殘留的液質聯用檢測方法的報道較少,未見關于同時檢測四環素類抗生素及其代謝產物殘留的文獻報道。而國外已開始四環素類抗生素代謝產物殘留檢測方法的研究。本研究建立了牛奶樣品中10種四環素類多殘留的高效液相色譜/串聯質譜確證方法,填補了國內外的技術空白,可為牛奶樣品中四環素類藥物及其代謝產物殘留的監督檢驗和殘留監控提供技術支持。2實驗部分2.1分析試劑的制備API3000型串聯質譜儀,配Agilent1100型高效液相色譜儀和電噴霧離子源;MinishakerMS1型旋渦混合器;UNIVERSAL32R型低溫離心機;ZYMARKLV型吹氮濃縮儀;固相萃取真空裝置(Agilent公司產),20孔;伏特pH510型pH計;Oasis?HLB固相萃取柱等。二甲胺四環素鹽酸鹽(Sigma公司,純度91%)、土霉素.2H2O(Sigma公司,純度99%)、四環素(Sigma公司,純度95%)、去甲基金霉素鹽酸鹽(Fluka公司,純度99%)、金霉素鹽酸鹽(Sigma公司,純度80%)、甲烯土霉素鹽酸鹽(Riedel-deHaen公司,純度99.4%)和強力霉素鹽酸鹽(Fluka公司,純度98%)、差向四環素(Acros公司,純度100%)、差向土霉素(Acros公司,純度97%)、差向金霉素(Acros公司,純度97%);甲醇、乙腈和三氟乙酸為色譜純試劑;其它試劑均為分析純試劑;水為高純水。0.1mol/LEDTA-Mcllvaine緩沖溶液:稱取檸檬酸(含1個結晶水)12.9g,Na2HPO410.9g,EDTA-Na237.2g,用高純水溶解并定容至1L,調節pH值至4.0±0.05。牛奶為市購。2.2儀器條件2.2.1進樣量及進樣量色譜柱:InertsilC8-3,5μm,150mm×2.1mmi.d.;流速:0.3mL/min;柱溫:30℃;進樣量:30μL。流動相:甲醇(A)-0.01mol/L三氟乙酸(B),洗脫梯度為:0min(5.0%A)→5.0min(30.0%A)→10.0min(33.5%A)→12.0min(65.0%A)→17.5min(65.0%A)→18.0min(5.0%A)→25.0min(5.0%A),共25min。2.2.2噴霧電壓is離子化模式:ESI+;質譜分辨率:單位分辨率;霧化氣(NEB):6.0L/min;氣簾氣(CUR):10.0L/min;噴霧電壓(IS):4500V;去溶劑溫度(TEM)500℃;去溶劑氣流700L/min;碰撞氣(CAD)6.0L/min(N2)。其它條件見表1。2.3聲-質-固相萃取液的制備稱取混勻試樣5g(精確至0.01g),置于50mL比色管中,用0.1mol/LEDTA-Mcllvaine緩沖溶液溶解并定容至50mL,旋渦混合1min,低溫超聲10mins,轉移至50mL聚丙烯離心管中,冷卻至4℃,以5000r/min離心10min(溫度低于15℃),過濾。準確吸取10mL提取液以1滴/秒的速度過WatersOasisHLB固相萃取柱,待樣液完全流出后,依次用5mL水和5mL甲醇-水(5∶95,V/V)淋洗,棄去全部流出液。減壓抽干5min,最后用10mL甲醇-乙酸乙酯(10∶90,V/V)洗脫。將洗脫液吹氮濃縮至干(溫度低于40℃),用1.0mL流動相溶解殘渣,低溫超聲5min,0.45μm濾膜過濾,供高效液相色譜/串聯質譜儀測定。3結果與討論3.1流動相的優化根據文獻,選擇InertsilC8柱作為分離柱對10種四環素類化合物進行分離條件優化。電噴霧離子源的最佳流速范圍為0.2～0.4mL/min。本研究采用0.3mL/min的流速,可保持較低的柱壓,有利于色譜柱的長期使用。以甲醇-乙腈-0.01mol/L的三氟乙酸水溶液為流動相對流動相的比例和洗脫梯度進行優化,結果發現在乙腈與甲醇共同存在的條件下,土霉素、差向土霉素和四環素3個組分的重構離子色譜峰始終存在交叉重疊,無法實現定量;有機相僅采用乙腈,土霉素與差向土霉素合為一個峰,無法實現土霉素與差向土霉素的準確定性和定量;有機相僅采用甲醇,經優化,可實現土霉素與差向土霉素的色譜分離。因此,有機相僅采用甲醇,經反復優化,采用2.2.1所示的流動相組成和洗脫梯度可達到較好的分離效果(見圖2)。3.2子離子的確定首先采用1mg/L的四環素、金霉素、土霉素、強力霉素、去甲基金霉素、甲烯土霉素、二甲胺四環素、差向四環素、差向金霉素、差向土霉素標準溶液分別以流動注射的方式在正離子模式下進行母離子全掃描,確定各種四環素類抗生素的分子離子,然后分別以各種四環素類抗生素的分子離子為母離子,對其子離子進行全掃描,在本研究的質譜條件下,各種四環素類抗生素主要產生表2所示的子離子。選取豐度較強、干擾較小的兩對子離子為定性離子(見表1)。最后以多反應監測(MRM)正離子模式優化去簇電壓(DP)、聚焦電壓(FP)、射入電壓(EP)、碰撞電壓(CE)、碰撞室射出電壓(CXP)、霧化氣(NEB)、氣簾氣(CUR)、碰撞氣(CAD)、噴霧電壓(IS)、離子化溫度(TEM)等質譜參數。四環素類抗生素的優化質譜條件見表1。3.3差向金霉素類抗生素提取凈化條件的確定由于四環素類抗生素的代謝產物差向四環素、差向土霉素、差向金霉素與四環素、土霉素、金霉素的分子結構和化學性質非常類似,因此四環素類抗生素及其代謝產物的提取與凈化條件可采用與四環素類抗生素完全相同的提取與凈化條件。3.4線性范圍、檢出限、測定低限逐級稀釋標準混合工作液進行液質聯用分析,測定結果用MicrosoftExcel軟件回歸,線性范圍為:50～1200μg/kg,檢出限為0.5～10.0μg/kg,測定低限為50μg/kg。回歸方程、相關系數、檢出限見表3(y為峰面積,x為四環素類藥物的濃度,μg/kg)。3.5精密度與回收率選用不含10種待測組分的牛奶樣品,分別加入50、100和200μg/kg3個濃度水平的10種四環素混合標準溶液,按2.3處理樣品,分析并測定其精密度及回收率,測得平均回收率(n=10)在74.4%～101%之間,相對標準偏差在1.8%～8.3%之間。均滿足國內外對殘留分析的要求,表明該方法