香港海鷗形菌aqman-mgb探針實時熒光pcr體系的建立與優化

2001年，香港的雷布斯特科姆科赫姆（lh）首次被發現并命名為香港。近年來,完全閉管在線檢測的實時熒光PCR技術的發展,解決了傳統PCR后電泳的污染問題,以其快速、特異、靈敏等特點而得到廣泛的應用1材料和方法1.1酶系統lhcq收cdc香港海鷗形菌HKU1株(廣東省CDC微檢所提供);香港海鷗形菌肇慶株LHZQ001(廣東省CDC微檢所菌種室提供);傷寒沙門氏菌、副傷寒沙門氏菌、痢疾志賀氏菌、副溶血性弧菌、單核增李斯特氏菌、大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、變形桿菌等菌株為本實驗室保存。1.2試劑和設備PremixExTaq1.3引物和探針設計參考GenBank香港海鷗形菌16SrRNA高保守基因序列,利用DNAstar、Primer5.0、PrimerExpress3.0軟件進行引物和TaqManMGB探針設計(表1),引物、探針位置以AF389085(HKU1)序列為參考。1.4樣品的采集和處理從轄區水產品市場中采集草魚、鳙魚、鯉魚、鯽魚四類淡水魚,共92份,參考文獻1.5dna模板的制備用接種環刮取過夜培養的香港海鷗形菌HKU1株菌苔,于100μl無菌蒸餾水中制備懸液,振蕩混勻,水浴煮沸10min,然后冰浴2～5min,10000r/min離心5min,上清液則為DNA模板。淡水魚腸拭子與腹瀉病人糞便的10%PBS懸液,振蕩混勻后5000r/min離心5min,取100μl上清液,按上述煮沸法進行核酸提取。1.6凝膠成像系統使用PCRAmplificationKit進行靶基因擴增,產物于2%瓊脂糖凝膠電泳30min,凝膠成像系統分析,在約59bp處有單一特異性亮帶。切膠純化PCR產物,并連接到pGEM-T載體中構建陽性質粒,轉化至EcoliDH5α增殖,然后用QIAprepSpinMiniprepKit抽提質粒,紫外分光光度計測量定值,-20℃保存備用。1.7實時熒光pcr反應系統的構建和優化根據PremixExTaq1.8實時熒光pcr特異性實驗對傷寒沙門氏菌、副傷寒沙門氏菌、痢疾志賀氏菌、副溶血性弧菌、單核增李斯特氏菌、大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、變形桿菌等非目標菌株,進行實時熒光PCR試驗,檢測反應體系的特異性。1.9實時熒光pcr靈敏度測試將香港海鷗形菌16SrRNA陽性質粒10倍梯度稀釋,取101.10實時熒光pcr重復實驗用同一濃度的陽性質粒進行16次平行檢測,對Ct值進行統計,計算Ct值的平均值和變異系數,以評價檢測體系的重復性。1.11臨床應用測試對采集到的92份淡水魚標本和211份腹瀉病人糞便標本提取DNA,進行實時熒光PCR檢測。同時,參考文獻方法2結果2.1熒光定量ps法在ABI7500fast實時熒光PCR優化后的反應條件:94℃10s;94℃5s,60℃20s(末端收集熒光),40個循環;采取fast模式。反應體積20μl,模板量加樣量1μl。反應體系中引物和探針的終濃度分別為0.4和0.2μmol/L時,為最佳反應濃度,可獲得最小的Ct值和最高的熒光增加值(△Rn)。2.2實時熒光pcr檢測菌株特異性、特異性擴增對傷寒沙門氏菌、副傷寒沙門氏菌、痢疾志賀氏菌、副溶血性弧菌、單核增李斯特氏菌、大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、變形桿菌進行的實時熒光PCR檢測,非目標菌株均無特異性擴增曲線,僅香港海鷗形菌有典形的“S”形擴增曲線。2.3反應系敏試驗的結果對香港海鷗形菌16SrRNA基因重組質粒102.4ct值的讀取同一次實驗內16個平行樣的檢測結果顯示,擴增曲線在閾值線附近基本上是重合的,Ct值讀數范圍為25.078～25.960,平均為25.683,標準偏差為0.047,變異系數為0.183%。表明本研究所建立反應體系重復性非常好。2.5腹瀉病人糞便標本檢測結果應用實時熒光PCR體系對92份淡水魚類和211份腹瀉病人糞便標本檢測,結果有12份擴增陽性,其中包括11份淡水魚標本和1份腹瀉病人糞便標本,其Ct值在16.35～24.13之間,原始標本核酸濃度較高(圖1)。而對上述303份標本進行細菌分離,均在12份核酸擴增陽性的標本中相應地分離出香港海鷗形菌,核酸陰性的標本未檢出目標菌。2方法檢測結果吻合度、靈敏度、特異度均為100%(表3)。對12株香港海鷗形菌進行16SrRNA序列測定和分析,與香港海鷗形菌HKU1同源性均在99.5%以上。3提高檢測速度香港海鷗形菌傳統的分離、培養、鑒定過程耗時費力,檢測周期長,不利于淡水魚產品的貿易通關。實時熒光PCR技術的應用可提高檢測速度。邱亞群等綜上所述,針對香港海鷗形菌16SrRNA保守基因建立的TaqMan-MGB探針實時熒光PCR反應體系及其應