藥品微生物檢驗特點及過程控制1第一頁，共四十八頁，2022年，8月28日藥品微生物檢驗特點及過程控制藥品因素環境影響培養觀察抽樣檢查破壞試驗方法驗證過程控制2中國藥品生物制品檢定所第二頁，共四十八頁，2022年，8月28日無菌/微生物限度檢查理念環境保證培養基保證無菌性檢查靈敏度檢查有效的方法方法驗證SOP操作有效的結果可靠的結論結果判斷3中國藥品生物制品檢定所第三頁，共四十八頁，2022年，8月28日微生物檢查的過程控制一、實驗設施（硬件——物質保障）二、檢驗程序（軟件——有效的結果）三、結果判斷（調查——可靠的結論）4中國藥品生物制品檢定所第四頁，共四十八頁，2022年，8月28日一、實驗設施實驗室系統操作環境關鍵設備對照培養基物質保障5中國藥品生物制品檢定所第五頁，共四十八頁，2022年，8月28日（一）、實驗室系統潔凈實驗條件有效性：整體10000級、局部100級。安全性：保護樣品、人員和環境。可操作性：方便、快捷、順暢。潔凈實驗條件的維護、驗證陽性菌實驗室達到P2生物安全標準6中國藥品生物制品檢定所第六頁，共四十八頁，2022年，8月28日實驗室改造示例：原布局圖

擬定布局圖

建議布局圖1

建議布局圖2

實驗室系統——中檢所微生物實驗室7中國藥品生物制品檢定所第七頁，共四十八頁，2022年，8月28日（一）、實驗室系統實驗室系統的管理與維護：1、屏障系統的有效性壓差、風速、微粒、照度（外包服務合同）2、清潔、靜態與動態監控、熏蒸3、環境菌庫酒精棉球分離微生物新潔爾滅分離微生物8中國藥品生物制品檢定所第八頁，共四十八頁，2022年，8月28日環境菌庫潔凈環境常見菌（浮游菌）：頭狀葡萄球菌（Staphylococcus

capitis）溶血葡萄球菌（Staphylococcus

haemolyticus）緩癥鏈球菌（Streptococcus

mitis）科氏葡萄球菌（Staphylococcus

cohnii）藤黃微球菌（Micrococcus

luteus）9中國藥品生物制品檢定所第九頁，共四十八頁，2022年，8月28日（二）、操作環境1、隔離器2、生物安全柜3、超凈工作臺10中國藥品生物制品檢定所第十頁，共四十八頁，2022年，8月28日（二）、操作環境分類樣品安全人員安全環境要求點評隔離器？驗證困難，滅菌不徹底：假陽性滅菌劑殘留：假陰性生物安全柜？動態驗證困難，不適合多任務的檢驗活動超凈工作臺經典、廉價、適合多任務的檢驗活動。提高實驗室新風供給、加強實驗室監控可以揚長避短11中國藥品生物制品檢定所第十一頁，共四十八頁，2022年，8月28日搽拭實驗菌株菌液計數回收計數回收率大腸埃希菌191894.7%金黃色葡萄球菌646093.8%菌液稀釋、分液的誤差為：5.5%表面搽拭操作的回收率大于99%12中國藥品生物制品檢定所第十二頁，共四十八頁，2022年，8月28日（三）、關鍵設備微生物檢查薄膜過濾儀一次性薄膜過濾培養器應急檢驗用一次性薄膜過濾培養器13中國藥品生物制品檢定所第十三頁，共四十八頁，2022年，8月28日（四）、對照培養基培養基適用性（靈敏度）；培養基性能穩定性（標準化）。對照培養基理化評價（可控性）生物學評價（有效性）回收率比較MPN比較生長曲線比較生態評價某些CRS原則固態培養基液態培養基瓊脂加減法14中國藥品生物制品檢定所第十四頁，共四十八頁，2022年，8月28日二、檢驗程序環境保證培養基保證無菌性檢查靈敏度檢查有效的方法方法驗證SOP操作有效的結果可靠的結論結果判斷15中國藥品生物制品檢定所第十五頁，共四十八頁，2022年，8月28日二、檢驗程序接受任務實驗方案實驗準備樣品核對實驗操作過程監控培養觀察有效的結果物質保障16中國藥品生物制品檢定所第十六頁，共四十八頁，2022年，8月28日實驗室管理規范（軟件）中檢所抗生素室微生物實驗室質量管理體系編寫說明及批準頁1實驗室概況1.1實驗室簡介1.2實驗室通訊資料1.3實驗室認可項目/參數表1.4實驗室平面圖及功能區域1.5儀器設備總覽1.6常備試劑耗材一覽表1.7實驗室發展目標2管理規范2.1安全管理2.2業務流程2.3人員管理（6個SOP）2.4樣品管理（3個SOP）3標準操作規程3.1檢驗工作SOP（13個）3.2儀器操作SOP（30個）3.3實驗記錄SOP（9個）4實驗室保障4.1實驗室設施、設備及消耗品供應商確定原則4.2實驗室設施服務商4.3實驗設備供應商4.4實驗室消耗品供應商17中國藥品生物制品檢定所第十七頁，共四十八頁，2022年，8月28日（一）、實驗準備實驗準備應堅持“平戰結合”，物質準備有備無患，應隨時保證“來之能戰”。尤其注意常備有效期要求的物品：培養基、沖洗液、濾器、小型實驗器材等。18中國藥品生物制品檢定所第十八頁，共四十八頁，2022年，8月28日實驗準備——無菌室專用酒精棉球制備

實驗準備——場地清潔

實驗準備——臺面清潔

19中國藥品生物制品檢定所第十九頁，共四十八頁，2022年，8月28日（二）、樣品核對盡快取得樣品，確保樣品傳遞過程中的完整性、安全性、有效性；仔細核對樣品及樣品資料，高度關注媒體公布樣品（問題樣品），同時盡量獲取非問題樣品及同類樣品，進行比較實驗、比較分析；樣品外觀檢查、完整性檢查。20中國藥品生物制品檢定所第二十頁，共四十八頁，2022年，8月28日樣品外觀檢查——欣弗

樣品外觀檢查——刺五加

樣品外觀檢查——雙黃連

樣品完整性真空檢漏

21中國藥品生物制品檢定所第二十一頁，共四十八頁，2022年，8月28日（三）、實驗操作不斷完善標準化操作規程（SOP），嚴格避免實驗室污染。實驗人員培養基實驗器材實驗環境檢驗結果待檢樣品原料輔料設備環境藥品（食品）人員藥品食品生產過程中可能污染微生物的主要環節藥品食品微生物檢查過程中可能污染微生物的主要環節22中國藥品生物制品檢定所第二十二頁，共四十八頁，2022年，8月28日實驗操作——物料進場消毒液搽拭物品外表面潔凈傳遞（風淋、紫外照射）雙層無菌包裝核心區外圍實驗操作——人員進場一更二更核心操作區實驗操作——無菌操作技術23中國藥品生物制品檢定所第二十三頁，共四十八頁，2022年，8月28日（四）、實驗過程監控樣品監控手指監控沉降菌監控無菌檢驗框架示意圖24中國藥品生物制品檢定所第二十四頁，共四十八頁，2022年，8月28日三、結果判斷長菌與否分離鑒定溯源調查結果報告可靠的結論有效的結果物質保障25中國藥品生物制品檢定所第二十五頁，共四十八頁，2022年，8月28日三、結果判斷

是不是微生物？是什么微生物？微生物來自哪里？幾點思考

參見：《FTIR法用于藥品檢出菌與藥品微生物檢驗潔凈室環境菌的相似性考察》《藥學學報》，2007，42（11）：1189～1194《判斷無菌檢查陽性結果有效性的實驗探討》《藥物分析雜志》，

2008，28（05）：66～71

26中國藥品生物制品檢定所第二十六頁，共四十八頁，2022年，8月28日1、長菌與否？渾不渾濁?物理變化、化學變化還是生物變化？一靠經驗二靠實驗三靠嚴格程序控制避免干擾27中國藥品生物制品檢定所第二十七頁，共四十八頁，2022年，8月28日是不是微生物？（1）、液體培養基渾濁物理變化？化學變化？生物學變化？（2）、平板上的菌落瓊脂表面、瓊脂中、瓊脂和平皿夾層

菌落or藥渣？28中國藥品生物制品檢定所第二十八頁，共四十八頁，2022年，8月28日菌落or藥渣？經60Coγ射線大劑量照射再檢驗延長培養時間到7天重新劃線培養鏡檢29中國藥品生物制品檢定所第二十九頁，共四十八頁，2022年，8月28日2、分離鑒定（1）立即轉接2ml該培養物至相同的培養基中繼續培養；（2）取5支凍存管，每管分裝1ml渾濁培養物，-80℃保存；（3）取渾濁培養物在TSA平板/血瓊脂上劃線，分離污染微生物；（4）如果發現硫乙醇酸鹽流體培養管變渾濁，還應增加血平板劃線，并在厭氧條件下培養分離厭氧菌。由平板分離到的菌落應進一步鑒定，并逐一保藏。30中國藥品生物制品檢定所第三十頁，共四十八頁，2022年，8月28日是什么微生物？宏觀：生長形態微觀：鏡檢鑒定：生化鑒定（API、BD）核酸鑒定（16sRNA、DNA）

……31中國藥品生物制品檢定所第三十一頁，共四十八頁，2022年，8月28日3、溯源調查樣品陽性培養物分離菌株檢驗過程監控菌株環境菌（近期、遠期）現場調查收集菌株鑒定與相似性分析相結合傳統方法與新技術相結合不同方法的交叉驗證32中國藥品生物制品檢定所第三十二頁，共四十八頁，2022年，8月28日微生物來自哪里？

相似性分析同源性分析脈沖場電泳（PFGE）、傅立葉紅外（FTIR）

33中國藥品生物制品檢定所第三十三頁，共四十八頁，2022年，8月28日SamplePreparationAutomatedmeasurementafterdryingofthesamples!2.Suspending1.Harvesting3.LoadingFT-IRSpektrumofmicroorganisms圖不同來源的陰溝腸桿菌紅外圖譜聚類關系34中國藥品生物制品檢定所第三十四頁，共四十八頁，2022年，8月28日TheInfraredSpectrumlipidsproteinscarbohydratessaltswatercellwallcapsulesDNA,RNAflagellates,piliribosomevacuoles...FT-IRspectrumisafingerprintofthecellsBiochemicalStructureofCells35中國藥品生物制品檢定所第三十五頁，共四十八頁，2022年，8月28日36中國藥品生物制品檢定所第三十六頁，共四十八頁，2022年，8月28日溯源性分析例1——欣弗事件

圖29欣弗培養物圖30欣弗培養物分離菌株鏡檢37中國藥品生物制品檢定所第三十七頁，共四十八頁，2022年，8月28日編號濾筒中形態革蘭染色BD鑒定0206L渾濁，產氣1、G-球桿菌2、G-短桿菌1、肺炎克雷伯肺炎亞種（Klebsiellapneumoniaessppneumoniae）；2、粘質沙雷菌（Serratiamarcescens）0206G渾濁，劇烈產氣1、G-球桿菌2、G-短桿菌1、肺炎克雷伯肺炎亞種（Klebsiellapneumoniaessppneumoniae）；2、粘質沙雷菌（Serratiamarcescens）0112G致密片狀、絮狀物，振搖不散G+長鏈桿菌（液體培養物直接涂片）0104L顆粒狀懸浮物，振搖能散G+長鏈桿菌（液體培養物直接涂片）298L；298G渾濁，產氣1、G-球桿菌2、G-短桿菌1、肺炎克雷伯肺炎亞種（Klebsiellapneumoniaessppneumoniae）；2、粘質沙雷菌（Serratiamarcescens）303L；303G渾濁，產氣1、G-球桿菌2、G-短桿菌1、肺炎克雷伯肺炎亞種（Klebsiellapneumoniaessppneumoniae）；2、陰溝腸桿菌（Enterobacter

cloacae）305L；305G渾濁，產氣1、G-球桿菌2、G-短桿菌1、肺炎克雷伯肺炎亞種（Klebsiellapneumoniaessppneumoniae）；2、粘質沙雷菌（Serratiamarcescens）306L；306G渾濁，產氣G-球桿菌肺炎克雷伯肺炎亞種（Klebsiellapneumoniaessppneumoniae）307G渾濁，產氣G-球桿菌肺炎克雷伯肺炎亞種（Klebsiellapneumoniaessppneumoniae）308L渾濁（Alcaligenesfaecalis）308G致密片狀、絮狀物，振搖不散G+長鏈桿菌（液體培養物直接涂片）309L渾濁（Alcaligenesfaecalis）309G致密片狀、絮狀物，振搖不散G+長鏈桿菌（液體培養物直接涂片）304G渾濁G-桿菌嗜麥芽寡養單胞菌（Stenotrophomonasmaltophilia）38中國藥品生物制品檢定所第三十八頁，共四十八頁，2022年，8月28日溯源性分析例1——欣弗事件頭狀葡萄球菌頭狀亞種（Staphylococcus

capitissspcapitis）溶血葡萄球菌（Staphylococcus

haemolyticus）緩癥鏈球菌（Streptococcus

mitis）科氏葡萄球菌科氏亞種（Staphylococcus

cohniissp

cohnii）藤黃微球菌（Micrococcus

luteus）溶血葡萄球菌（Staphylococcus

haemolyticus）。監測到的環境菌株39中國藥品生物制品檢定所第三十九頁，共四十八頁，2022年，8月28日溯源性分析例2編號BD鑒定走廊1B.pumilus走廊2M.luteus走廊3/無菌室4C.urealyticum無菌室5K.kristinae無菌室6C.urealyticumC1524-FS.capraeC1524-BS.capraeC1525-B1-1S.warneriC1525-B1-2S.epidermidisC1525-B2S.warneriC1525-F1S.warneriC1525-F2-1S.capitisC1525-F2-2S.epidermidisC1526-B1C.urealyticumC1526-B2S.warneriC1526-F1S.epidermidisC1526-F2S.haemolyticus菌株16sRNA鑒定可信度C1524-FS.haemolyticus99%C1524-BS.haemolyticus98%C1526-F2S.haemolyticus100%雙黃連注射液利巴韋林注射液FTIR相似性分析DuPontRiboPrinter基因指紋分析40中國藥品生物制品檢定所第四十頁，共四十八頁，2022年，8月28日幾點思考（1）、怎樣才算是同一株菌？

需要深入認識微生物本身微生物變異與保守的相對性；分析方法的可變性與微生物本身的可變性；生物學先鋒琳恩·馬古利斯(LynnMargulis)曾表示：“如果將一個特殊的質粒植入大腸桿菌，大腸桿菌便會突然間變成克雷伯氏桿菌”。41中國藥品生物制品檢定所第四十一頁，共四十八頁，2022年，8月28日幾點思考（2）、什么是最適宜的技術？

需要深入認識分析微生物的技術和手段形態學分析與相似性分析（生化反應譜、片段相似性、FTIR光譜相似性等），在權衡方法本身的邊界