細菌內(nèi)毒素凝膠試驗法第一頁，共五十三頁，2022年，8月28日一、試驗程序1、試驗準備：試劑、儀器及用具等；2、確定藥品細菌內(nèi)毒素限值（L）；3、選擇鱟試劑靈敏度（λ）；4、計算供試品最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）和最低有效濃度（MVC）；5、鱟試劑靈敏度復核；6、藥品與鱟試劑相溶性的初篩試驗；7、供試品干擾試驗；8、干擾試驗的驗證；9、供試品日常的內(nèi)毒素限量檢查第二頁，共五十三頁，2022年，8月28日二、實驗儀器設(shè)備

1、分析天平

2、凈化工作臺

3、電熱恒溫干燥箱（0～300℃）

4、電熱恒溫水浴鍋（37±1℃）或干式恒溫培養(yǎng)器

5、溫度計（100±1℃

）

6、旋渦混合器第三頁，共五十三頁，2022年，8月28日三、實驗材料和器具

1、試管架

2、鑷子

3、消毒棉球

4、稱量瓶(30×60mm)5、刻度吸管(1、2、5、10、15ml)6、各種試管(10×75mm)7、中號金屬飯盒

8、加樣器第四頁，共五十三頁，2022年，8月28日三、實驗材料和器具

9、移液器或刻度吸管與吸耳球

10、無熱原吸頭

11、酒精燈

12、打火機

13、剪刀

14、砂輪

15、封口膜

16、記號筆或標記紙第五頁，共五十三頁，2022年，8月28日四、實驗材料和器具處理凡是與供試品或反應試劑接觸的器具必須經(jīng)除熱原處理。

1、玻璃：飲用水清凈控干鉻酸洗液浸泡4小時飲用水洗凈洗液飲用水浸泡3次（每次30分鐘）純化水沖洗三次干燥裝入飯盒250℃干烤至少1小時自然冷卻至室溫24小時內(nèi)使用。第六頁，共五十三頁，2022年，8月28日四、實驗材料和器具處理

1、塑料：飲用水清凈控干純化水沖洗三次干燥6%雙氧水浸泡或環(huán)氧乙烷消毒密封，備用。但必須經(jīng)過驗證，必須無熱原且不干擾細菌內(nèi)毒素的檢查。第七頁，共五十三頁，2022年，8月28日五、試劑

1、鱟試劑（TAL）：

2、細菌內(nèi)毒素國家標準品（RSE）：

3、細菌內(nèi)毒素工作標準品（CSE）：

4、細菌內(nèi)毒素檢查用水（BET水）：

5、鉻酸洗液：

6、75%酒精：

7、供試品：第八頁，共五十三頁，2022年，8月28日六、鱟試劑靈敏度復核試驗（一）試驗程序：內(nèi)毒素毒素RSE和CSEBET水復溶混勻稀釋為2λ、λ、0.5λ、0.25λ內(nèi)毒素標準溶液旋渦混合器混合15分鐘鱟試劑TALBET水復溶混勻單次管：原安瓿多次管：反應試管輕輕轉(zhuǎn)動瓶壁搖勻每步稀釋于旋渦混合器混合30秒0.1mlTAL+0.1mlCSE（RSE），平行4管NC：0.1mlTAL+0.1mlBET水，平行2管第九頁，共五十三頁，2022年，8月28日六、鱟試劑靈敏度復核試驗37℃±1℃,60±2min結(jié)果判斷：反應管緩緩倒轉(zhuǎn)1800陽性（+）：凝膠不變形，不從管壁滑脫者陰性（-）：凝膠不能保持完整，從管壁滑脫者實驗有效：NC管全部呈陰性（--）2.0λ管全部呈陽性（++++）0.25λ管全部呈陰性（----）數(shù)據(jù)處理：靈敏度測定值λc＝lg-1(∑X/4)X：為反應終點濃度的對數(shù)值（lg）鱟試劑靈敏度標示值λ有效：2λ≥λc≥0.5λ封口，混勻反應終點濃度是系列濃度遞減的內(nèi)毒素溶液中最后一個呈陽性結(jié)果的濃度第十頁，共五十三頁，2022年，8月28日六、鱟試劑靈敏度復核試驗（二）試驗操作基本程序：1、試劑準備：2、調(diào)節(jié)恒溫水浴箱或培養(yǎng)器溫度為37±1℃；3、制備內(nèi)毒素標準溶液2λ、λ、0.5λ、0.25λ（0.25EU/ml、0.125EU/ml、0.06EU/ml、0.03EU/ml）；試劑名稱生產(chǎn)廠家復溶體積或裝量標示靈敏度或效價數(shù)量TAL×××0.5ml/支0.125EU/ml5CSE×××1.0ml/支20EU/支1BET水×××30ml/瓶1第十一頁，共五十三頁，2022年，8月28日六、鱟試劑靈敏度復核試驗（1）取CSE一支，用砂輪在安瓿頸上部劃痕，用75%酒精棉球擦拭后，折斷；（2）用刻度吸管或移液器準確吸取BET水1.0ml加入CSE安瓿內(nèi)，用封口膜封口，于旋渦混合器上混合15min，即制成20EU/ml的內(nèi)毒素標準溶液；（3）再將內(nèi)毒素標準溶液按20EU/ml→2.0EU/ml→1.0EU/ml→0.5EU/ml→0.25EU/ml→0.125EU/ml→0.06EU/ml→0.03EU/ml步驟進行稀釋；

第十二頁，共五十三頁，2022年，8月28日六、鱟試劑靈敏度復核試驗

1）取試管架，將7支稀釋管按2.0EU/ml、1.0EU/ml、0.5EU/ml、0.25EU/ml、0.125EU/ml、0.06EU/ml、0.03EU/ml的順序編號排入試管架上；

2）用刻度吸管或移液器準確吸取3.6ml、3.0ml、3.0ml、3.0ml、3.0ml、3.0ml、3.0mlBET水加入上述7支稀釋管內(nèi)；

3）另取一支刻度吸管或吸頭，準確吸取0.8ml的20EU/ml內(nèi)毒素標準溶液按，加入3.6mlBET水稀釋管內(nèi)，在旋渦混合器上混合30s，制成2.0EU/ml內(nèi)毒素素標準液；第十三頁，共五十三頁，2022年，8月28日六、鱟試劑靈敏度復核試驗

4）以后每步稀釋需另一支刻度吸管或吸頭，準確吸取3.0ml相應濃度的內(nèi)毒素標準溶液加入相應的3.0mlBET水的稀釋管中，在混合器上混合30s，同法依次制備成1.0EU/ml、0.5EU/ml、0.25EU/ml、0.125EU/ml、0.06EU/ml、0.03EU/ml的內(nèi)毒素標準溶液。如下圖所示。第十四頁，共五十三頁，2022年，8月28日六、鱟試劑靈敏度復核試驗3.0ml3.0ml3.0ml3.0ml3.0ml3.0ml3.6ml1.0ml0.4ml3.0mlBET水CSE3.0ml3.0ml3.0ml3.0ml3.0ml15min30s30s30s30s30s30s20EU/ml2.0EU/ml1.0EU/ml0.5EU/ml0.25EU/ml0.125EU/ml0.06EU/ml0.03EU/ml第十五頁，共五十三頁，2022年，8月28日六、鱟試劑靈敏度復核試驗

4、細菌內(nèi)毒素（TAL）的準備（1）取TAL5支，用砂輪在安瓿頸部劃痕，用75%的酒精棉球擦拭后，折斷（避免玻璃屑落入安瓿內(nèi)）；（2）用刻度吸管或移液器準確吸取BET水0.5ml沿瓶壁加入TAL的安瓿內(nèi)，輕輕轉(zhuǎn)動瓶壁使內(nèi)容物全部溶解（避免產(chǎn)生氣泡），將復溶后的TAL分別吸取移至一玻璃瓶內(nèi)混合均勻；第十六頁，共五十三頁，2022年，8月28日六、鱟試劑靈敏度復核試驗（3）取試管架一個，按0.25EU/ml、0.125EU/ml、0.06EU/ml、0.03EU/ml、NC順序做標記后，插入10×75mm反應試管，各內(nèi)毒素濃度平行4管，NC平行2管；（4）用刻度吸管或移液器準確吸取TAL溶液0.1ml分別加入每支反應試管中。

5、加樣：NC管各加入0.1mlBET水，其它各反應管分別各加入0.1ml相應濃度的內(nèi)毒素標準溶液。如下圖。第十七頁，共五十三頁，2022年，8月28日六、鱟試劑靈敏度復核試驗0.1mlTALCSE0.25EU/ml0.125EU/ml0.06EU/ml0.03EU/mlNC0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml第十八頁，共五十三頁，2022年，8月28日六、鱟試劑靈敏度復核試驗

6、封口：用封口膜封口，或用醫(yī)用膠布在酒精燈火焰上通過1～2次后封口，輕輕混勻（避免產(chǎn)生氣泡），將反應連同試管架放入37±1℃恒溫水浴箱（或?qū)⒃嚬苤苯臃湃敕磻鳎┲校?0±2分鐘（保溫過程中應避免震動而影響凝膠的形成）。

7、結(jié)果記錄：將反應管從水浴中輕輕取出，緩緩倒轉(zhuǎn)1800,若管內(nèi)凝膠顯示堅實不變形者為陽性，記錄為“+”；若管內(nèi)無凝膠形成，或雖有凝膠但不能保持完整，從管壁滑脫者，均判為陰性，記錄為“-”。如下圖。第十九頁，共五十三頁，2022年，8月28日六、鱟試劑靈敏度復核試驗++++----第二十頁，共五十三頁，2022年，8月28日六、鱟試劑靈敏度復核試驗陰性陽性第二十一頁，共五十三頁，2022年，8月28日六、鱟試劑靈敏度復核試驗8、數(shù)據(jù)處理：（1）判斷依據(jù)：如果最大濃度2λ的4支管均為陽性，最小濃度的0.25λ的4支管均為陰性，按下式計算反應終點濃度的幾何平均值，即為TAL靈敏度的的測定值（λc）。λc＝lg-1(∑X/4)X：為反應終點濃度的對數(shù)值（lg）當2.0λ≥λc≥0.5λ時，鱟試劑靈敏度標示值λ有效。第二十二頁，共五十三頁，2022年，8月28日六、鱟試劑靈敏度復核試驗（2）反應結(jié)果：平行管數(shù)內(nèi)毒素標準溶液濃度（EU/ml）NC反應終點濃度X（反應終點濃度）0.250.1250.060.031+++--0.06-1.222++---0.125-0.9033++---0.125-0.9034++---0.125-0.903

（3）數(shù)據(jù)處理：λc＝lg-1(∑X/4)＝lg-1{[(-1.22)+(-0.903)+(-0.903)+(-0.903)/4]}＝0.104EU/ml第二十三頁，共五十三頁，2022年，8月28日六、鱟試劑靈敏度復核試驗9、結(jié)果判斷：

λc在2.0λ≥λc≥0.5λ（0.25EU/ml～0.06EU/ml）范圍內(nèi)，本批鱟試劑（TAL）和靈敏度標示值符合規(guī)定，應按標示值使用！第二十四頁，共五十三頁，2022年，8月28日七、供試品干擾試驗

1、供試品在進行細菌內(nèi)毒素檢查之前，即通過比較鱟試劑在內(nèi)毒素水溶液和內(nèi)毒素供試品溶液中反應的差異程度，來確定供試品在該濃度下是否對細菌內(nèi)毒素檢查有干擾。

2、如鱟試劑和供試品有以下改變，則須重新進行干擾試驗：（1）鱟試劑來源改變；（2）鱟試劑的配方和生產(chǎn)工藝的改變；第二十五頁，共五十三頁，2022年，8月28日七、供試品干擾試驗（3）供試品來源的改變；（4）供試品的配方和生產(chǎn)工藝的改變。3、試驗程序：（1）計算：供試品細菌內(nèi)毒素限值L=K/M；（2）選擇：鱟試劑的靈敏度λ；（3）計算：供試品的最大有效稀釋倍數(shù)MVD=L/λ或最低有效濃度MVC=λ/L=C/MVD；第二十六頁，共五十三頁，2022年，8月28日七、供試品干擾試驗（4）根據(jù)初篩試驗選擇：供試品有效稀釋倍數(shù)（≤MVD）或有效濃度（≥MVC）；（5）制備：2λ、λ、0.5λ、0.25λ內(nèi)毒素水溶液Es系列；2λ、λ、0.5λ、0.25λ內(nèi)毒素供試品溶液Et系列；（6）反應：TAL+BET水（NC）、TAL+供試品溶液（NPC）各平行2管；TAL+Es系列、TAL+Et系列各平行4管；第二十七頁，共五十三頁，2022年，8月28日七、供試品干擾試驗（7）結(jié)果判斷：NC管全部陰性（--），NPC管全部陰性(--)；TAL+Es系列：2λ管全部陽性（++++），0.25λ管全部陰性（----）；TAL+Et系列：2λ管全部陽性（++++），0.25λ管全部陰性（----）。試驗有效。第二十八頁，共五十三頁，2022年，8月28日七、供試品干擾試驗（8）數(shù)據(jù)處理：Es系列反應終點濃度幾何平均值：Es=lg-1(∑Xs/4)；Et系列反應終點濃度幾何平均值：Et=lg-1(∑Xs/4)；X：為反應終點濃度的對數(shù)值（lg）；供試品在該濃度下無干擾：2.0λ≥Es≥0.5λ，2.0λ≥Et≥0.5λ；若供試品在該濃度下有干擾，選擇靈敏度更高的鱟試劑。第二十九頁，共五十三頁，2022年，8月28日七、供試品干擾試驗

4、干擾試驗程序：（1）試劑準備：

（2）硫酸慶大霉素注射液細菌內(nèi)毒素限值L為0.5EU/1000U。試劑名稱生產(chǎn)廠家復溶體積或裝量標示靈敏度或效價數(shù)量TAL×××0.5ml/支0.125EU/ml5CSE×××1.0ml/支20EU/支1BET水×××30ml/瓶1硫酸慶大霉素注射液×××20000U/ml1第三十頁，共五十三頁，2022年，8月28日七、供試品干擾試驗（3）硫酸慶霉素注射液：CL2000U×0.5EU/1000MVD=—

=——————————=80倍

λ0.125EU/ml或

λC20000U/mlMVC=—

=——=——————=250U/mlLMVD80第三十一頁，共五十三頁，2022年，8月28日七、供試品干擾試驗(4)制備：1）2λ、λ、0.5λ、0.25λ（0.25EU/ml、0.125EU/ml、0.06EU/ml、0.03EU/ml）內(nèi)毒素水溶液Es系列（方法同鱟試劑靈敏度復核中內(nèi)毒素標準溶液的制備）；2）2λ、λ、0.5λ、0.25λ內(nèi)毒素供試品溶液Et系列（用供試品稀釋液代替BET水對內(nèi)毒素進行稀釋）。第三十二頁，共五十三頁，2022年，8月28日七、供試品干擾試驗2.0ml2.0ml2.0ml2.0ml2.0ml2.0ml3.6ml1.0ml0.4ml2.0mlCSE2.0ml2.0ml2.0ml2.0ml2.0ml15min30s30s30s30s30s30s20EU/ml2.0EU/ml1.0EU/ml0.5EU/ml0.25EU/ml0.125EU/ml0.06EU/ml0.03EU/ml硫酸慶大霉素注射液1：40（500U/ml）的稀釋液的制備（5）TAL的準備：同TAL靈敏度復核中TAL的準備。第三十三頁，共五十三頁，2022年，8月28日七、供試品干擾試驗（6）加樣：

1）NC：0.1mlTAL+0.1mlBET水，平行2管；

2）NPC：0.1mlTAL+0.1ml供試品稀釋液，平行2管；

3）TAL+Es系列：、0.125EU/ml、0.06EU/ml、0.03EU/ml內(nèi)毒素水溶液各平行4管；

4）TAL+Et系列：、0.125EU/ml、0.06EU/ml、0.03EU/ml內(nèi)毒素供試品溶液各平行4管。第三十四頁，共五十三頁，2022年，8月28日七、供試品干擾試驗（7）反應：37℃±1℃保溫60±2分鐘。（8）數(shù)據(jù)處理：

1）判斷依據(jù)：0.1mlTALCSEBET水0.25EU/ml0.125EU/ml0.06EU/ml0.03EU/mlNC0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml第三十五頁，共五十三頁，2022年，8月28日七、供試品干擾試驗

0.1mlTALCSE供試品溶液0.25EU/ml0.125EU/ml0.06EU/ml0.03EU/mlNC0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml第三十六頁，共五十三頁，2022年，8月28日七、供試品干擾試驗如果最大濃度2λ的4支管均為陽性，最小濃度的0.25λ的4支管均為陰性，按下式計算：

Es系列反應終點濃度幾平均何值：Es＝lg-1(∑Xs/4)Et系列反應終點濃度幾平均何值：Et＝lg-1(∑Xt/4)X：為反應終點濃度的對數(shù)值（lg）當2.0λ≥Es≥0.5λ，2.0λ≥Es≥0.5λ時，供試品在該濃度下無干擾。第三十七頁，共五十三頁，2022年，8月28日七、供試品干擾試驗

2）反應結(jié)果：平行管數(shù)Es系列內(nèi)毒素濃度（EU/ml）NC反應終點濃度X（反應終點濃度）0.250.1250.060.031+++--0.06-1.222++---0.125-0.9033++--0.125-0.9034++--0.125-0.903平行管數(shù)Et系列內(nèi)毒素濃度（EU/ml）NC反應終點濃度X（反應終點濃度）0.250.1250.060.031+++--0.06-1.222++---0.125-0.9033++--0.125-0.9034++--0.125-0.903第三十八頁，共五十三頁，2022年，8月28日七、供試品干擾試驗3）試驗有效：NC管全部陰性（--），NPC管全部陰性(--)；TAL+Es系列：2λ管全部陽性（++++），0.25λ管全部陰性（----）；TAL+Et系列：2λ管全部陽性（++++），0.25λ管全部陰性（----）。試驗有效。第三十九頁，共五十三頁，2022年，8月28日七、供試品干擾試驗

4）數(shù)據(jù)處理：

Es系列反應終點濃度幾何平均值：Es=lg-1(∑Xs/4)=lg-1｛[(-1.22)+(-0.903)+(-0.903)+(-0.903)]/4}=0.104EU/mlEt系列反應終點濃度幾何平均值：Et=lg-1(∑Xs/4)=lg-1｛[(-1.22)+(-0.903)+(-0.903)+(-0.903)]/4}=0.104EU/ml

第四十頁，共五十三頁，2022年，8月28日七、供試品干擾試驗（9）結(jié)果判斷Es和Et分別在2.0λ～0.5λ（0.25EU/ml～0.06EU/ml）范圍內(nèi)，供試品在該濃度下無干擾。第四十一頁，共五十三頁，2022年，8月28日八、供試品細菌內(nèi)毒素檢查

1、檢查用反應管數(shù)量：供試品管2支；陰性對照管1支；陽性對照管1支；供試品陽性對照管1支。第四十二頁，共五十三頁，2022年，8月28日八、供試品細菌內(nèi)毒素檢查2、檢查程序：供試品：按MVD稀釋—→供試品溶液；內(nèi)毒素：BET水復溶—→稀釋為2λ內(nèi)毒素水溶液；供試品溶液復溶—→稀釋為2λ內(nèi)毒素的供試品溶液；鱟試劑：BET復溶—→原安瓿或反應管。第四十三頁，共五十三頁，2022年，8月28日八、供試品細菌內(nèi)毒素檢查

3、檢查加樣：供試品管NCPCPPC

加樣0.1mlTAL0.1ml供試液0.1mlBET水0.1ml2λ內(nèi)毒素水溶液0.1ml2λ內(nèi)毒素供試品溶液平行管數(shù)2111

封口、混合、孵育反應條件

37℃±1℃保溫60±2分鐘

結(jié)果判斷符合規(guī)定---++不符合規(guī)定++-++需要復測+--++復測符合規(guī)定-----++復測不符合規(guī)定+----++試驗無效+++試驗無效--+試驗無效-+-第四十四頁，共五十三頁，2022年，8月28日八、供試品細菌內(nèi)毒素檢查

4、樣品檢查：（1）硫酸慶大霉素注射液細菌內(nèi)毒素限值L為0.5EU/1000U。（2）根據(jù)干擾試驗結(jié)果，可選擇靈敏度為0.125EU/ml的TAL對硫酸慶大霉素注射液按最大有效稀釋倍數(shù)進行日常檢查。第四十五頁，共五十三頁，2022年，8月28日八、供試品細菌內(nèi)毒素檢查（3）硫酸慶霉素注射液：CL2000U×0.5EU/1000MVD=—

=——————————=80倍

λ0.125EU/ml或

λC20000U/mlMVC=—

=——=——————=250U/mlLMVD80第四十六頁，共五十三頁，2022年，8月28日八、供試品細菌內(nèi)