在細胞工程中，植物原生質體不但是植物細胞雜交良好的親本，而且是植物細胞遺傳工程的理想受體，此外，植物原生質體也是細胞生物學研究的很有用的實驗材料。植物原生質體的分離和培養是達到這些目的的重要技術基礎，因此，掌握和運用這一技術是十分重要的。第1頁/共50頁第一頁，共51頁。第2頁/共50頁第二頁，共51頁。

二.植物原生質體的基本特點與作用

植物原生質體是脫掉了細胞壁的、僅有質膜包圍、裸露的、活植物細胞。與完整的植物細胞相比，它有下列主要特點：單細胞，在同一時間內能得到大量的遺傳上同質的原生質體，用它可象細菌細胞那樣進行多種遺傳學研究。不親和障礙，為較遠緣的植物細胞雜交提供了融合親本。第3頁/共50頁第三頁，共51頁。二.植物原生質體的基本特點與作用外源顆粒，如DNA，質粒、病毒、細菌和其它細胞器，因此在植物遺傳工程中有重要作用。4.植物原生質體也和植物細胞一樣，具有該植物體的全部遺傳信息，在合適的培養條件下，它能象一粒種子那樣發育成與其親本相似的新的植物，即具有遺傳全能性。第4頁/共50頁第四頁，共51頁。二.植物原生質體的基本特點與作用細胞壁的生物合成提供了方便。細胞膜與信息的傳遞，能量的轉換，物質的運輸等基本現象之間的密切聯系提供了可能。受體，同時又是分離細胞內各種細胞器，如細胞核、葉綠體、線粒體等的好材料。見圖1：第5頁/共50頁第五頁，共51頁。第6頁/共50頁第六頁，共51頁。三.植物原生質體的材料來源

研究表明，幾乎能從植物的所有部位得到原生質體(詳見圖二)，其中以葉片為多，因為植物葉肉細胞的原生質體有下面幾個優點：1.取材容易，植株可來自盆栽和溫室栽培，也可在試管中培育無菌苗。2.原生質體在生理和遺傳特性上比較一致。第7頁/共50頁第七頁，共51頁。三.植物原生質體的材料來源3.比較容易用酶解法分離。根尖組織也是植物原生質體的重要來源，它可由各種植物的種子萌發后取得。花粉經特異酶處理也能得到原生質體，在單倍體遺傳育種中有特殊的用途。第8頁/共50頁第八頁，共51頁。三.植物原生質體的材料來源原生質體也可以從組織培養的材料中大量獲得。由于組織培養的嚴格條件，使得材料的重復性好，實驗材料可做到常年供應。值得注意的是，在考慮分離植物原生質體時，既要采用容易獲得原生質體的植物材料，但更重要的是要選用易于再生完整植株的細胞。詳見圖2

第9頁/共50頁第九頁，共51頁。第10頁/共50頁第十頁，共51頁。

四.植物原生質體的分離和純化

(一)原生質體的分離旱在1892年就有人用機械法分離原生質體。直到1960年，英國的科金(Cocking)首先采用酶解法分離原生質體，這一重要發現開辟了細胞工程研究的許多領域，作出了巨大的貢獻。第11頁/共50頁第十一頁，共51頁。四.植物原生質體的分離和純化酶解法有下面幾個優點：l能獲得大量的原生質體；l條件溫和，原生質體完整性好；l原生質體純凈度高；下面以葉片和懸浮培養的細胞為材料介紹分離原生質體的一般步驟：(詳見圖3)第12頁/共50頁第十二頁，共51頁。第13頁/共50頁第十三頁，共51頁。四.植物原生質體的分離和純化1.材料的準備與消毒：取充分展開的幼葉，用自來水沖冼干凈后，放入70%灑精中進行表面消毒，再放入2%的次氯酸鈉溶液中處理10分鐘，再用無菌水沖冼3-4次。懸浮培養的細胞一般是用胚性細胞，這有利于原生質體的再生。2.酶解：用鑷子撕去葉子的下表皮后，切成2厘米見方的小片，使去表皮的一層朝下放入酶液中處理，在25-28攝氏度，黑暗條件下酶解3-4小時。若采用懸浮培養的細胞，則采用繼代3天的細胞最好，經離心收集細胞，放入酶液中置低速轉床酶解8-12小時。分離植物原生質體常用試劑見表1.第14頁/共50頁第十四頁，共51頁。四.植物原生質體的分離和純化第15頁/共50頁第十五頁，共51頁。(二)原生質體的純化

植物材料經酶解后純化原生質體的步驟如下：1.酶解懸浮液用400目的不銹鋼或尼龍網過濾，以除去未消化的碎片。2.將含有原生質體的酶液收集到離心管中，低速離心使原生質體沉于管底，倒掉上清液。第16頁/共50頁第十六頁，共51頁。(二)原生質體的純化3.在離心管中加入適量的洗滌液，并離心。4.重復上述操作三次，使酶解液充分除去，最后用原生質體培養液洗滌一次。上述的離心純化法可細分為：A．沉降法；B．漂浮法；C．沉降法和漂浮法結合等三種。(詳見圖4)

第17頁/共50頁第十七頁，共51頁。四.植物原生質體的分離和純化第18頁/共50頁第十八頁，共51頁。第19頁/共50頁第十九頁，共51頁。(三)原生質體的活力測定

用于培養和細胞工程操作的必須是健康的有活力的原生質體。方法有二：一是憑借形態可識別原生質體的存活性。二是采用特異的染色方法來確定，可用0.1%酚藏花紅液染色，活的原生質體能著紅色；最好是采用熒光素雙醋酸酯(FDA)染色。有活力的原生質體帶有熒光，無活力的不產生熒光。第20頁/共50頁第二十頁，共51頁。第21頁/共50頁第二十一頁，共51頁。第22頁/共50頁第二十二頁，共51頁。五.影響原生質體分離的幾個因素

1.材料不同其細胞壁的組成和結構也有差異。因此分解細胞壁的酶的種類和濃度也不相同，如分離根尖細胞的原生質體要有較多的果膠酶。2.滲透壓穩定劑的種類和濃度也因材料不同而有變化。3.在酶液中加入適量的氯化鈣和磷酸二氫鉀作為原生質體穩定劑，可增強質膜的穩定性。第23頁/共50頁第二十三頁，共51頁。五.影響原生質體分離的幾個因素pH值也直接影響分離的速度和穩定性。pH值低則分離速度較快，而損壞的較多；pH值高則分離速度較慢，而完整性較好；故酶液的pH值一般為57左右。5.取材植株的生理狀態也是重要的因素，如采用懸浮培養的細胞一般用繼代三天的較為理想。(詳見表二)第24頁/共50頁第二十四頁，共51頁。六.培養原生質體的幾種方法

原生質體經分離和純化后，需要進行活力測定和計數。原生質體培養時有一種密度效應，一般在每毫升培養液中應有10個左右的原生質體有利于培養。計數可用血球計數板進行。常用的原生質體培養方法有以下幾種：(詳見圖5)1.液體培養法：是把純化后的原生質體懸浮于液體培養基中的培養方法。又可分為液體淺層培養法和液體懸滴法二種。第25頁/共50頁第二十五頁，共51頁。六.培養原生質體的幾種方法2.固體平板法：它是把原生質體均勻地埋入瓊脂培養基中的培養方法。3.雙層培養法：是在瓊脂培養基上部加入一薄層液體原生質體培養液的培養方法。4.瓊脂糖包埋法：同固體平板法。詳見圖5第26頁/共50頁第二十六頁，共51頁。六.培養原生質體的幾種方法第27頁/共50頁第二十七頁，共51頁。七.植物原生質體的發育和植株再生

植物原生質體在培養過程中，一般要經過下面幾個不同的階段：1.細胞壁再生：2.細胞分裂：3.愈傷組織或胚狀體的形成：4.植株再生：有二條途徑，一是從愈傷組織誘導形態發生；二是誘導胚狀體。第28頁/共50頁第二十八頁，共51頁。第29頁/共50頁第二十九頁，共51頁。第30頁/共50頁第三十頁，共51頁。八.原生質體融合原生質體融合，也叫體細胞雜交，就是使分離出來的不同親本的原生質體之間在人工控制的條件下，像性細胞受精作用那樣互相融合成一體。受精作用是一種自發的融合，而原生質體由于質膜表面帶有負電荷，它們之間通常是相互排斥的，所以自然融合頻率極低。所以要采用一定的方法加以誘導以促進原生質體的融合。第31頁/共50頁第三十一頁，共51頁。八.原生質體融合第32頁/共50頁第三十二頁，共51頁。八.原生質體融合第33頁/共50頁第三十三頁，共51頁。八.原生質體融合原生質體的融合過程第34頁/共50頁第三十四頁，共51頁。八.原生質體融合原生質體的融合過程第35頁/共50頁第三十五頁，共51頁。八.原生質體融合第36頁/共50頁第三十六頁，共51頁。八.原生質體融合（一）原生質體融合的方法1.無機鹽誘導融合用來做融合劑的無機鹽是硝酸鈉，1972年Carlsony就是用它來融合煙草的原生質體，并首次獲得種間的體細胞雜種。其原理是硝酸鈉的作用是中和了質膜的負電荷，使原生質體不再相互排斥，而緊密結合在一起，但硝酸鈉對原生質體有害作用，且誘導頻率也很低，所以目前很少有人采用。第37頁/共50頁第三十七頁，共51頁。第38頁/共50頁第三十八頁，共51頁。八.原生質體融合2.聚二乙醇（PEG）與高pH的Ca2+相結合的誘導融合法（1）以常規的方法收集原生質體，將兩親本的原生質體高密度等體積混合。（2）滴3滴混合的原生質體懸浮液于載玻片上，放置10分鐘。（3）加PEG450μL。PEG的制備方法：1gPEG加入的2mlmol/Lmmol/LCaCl2mmol/LKH2PO4溶液中，再放置10－20分鐘。第39頁/共50頁第三十九頁，共51頁。八.原生質體融合(4)ml高Ca2+、高pH溶液，間隔10分鐘再加一次。其組成是50mmol/LCaCl2、50mmol/L的甘氨酸鈉，pH10.5。(5)加1ml原生質體培養基洗滌，洗滌5次，每次間隔5分鐘。(6)最后加300--500μL原生質體培養基，以微滴形式培養。第40頁/共50頁第四十頁，共51頁。八.原生質體融合用此方法的誘導頻率可以高達10%--50%。并無種屬特性，幾乎可以誘導任何原生質體之間的融合。其原理是PEG是一種略帶負電的高分子化合物，在原生質體的融合中起到一種橋的作用，可以使原生質體凝聚，而鈣離子的加入會在質膜與PEG中間起到連接作用。在洗脫PEG過程中，會導致質膜表面電荷重排。由于粘連的質膜大面積緊密相連，這種電荷的重排會導致一個原生質體的負性電荷部分與另一個原生質體的正電荷部分相連而導致融合。第41頁/共50頁第四十一頁，共51頁。P1P2P1P2高Ca2+高pH融合洗滌培養選擇混合靜止1min加入PEG加入培養基融合技術要點：第42頁/共50頁第四十二頁，共51頁。第43頁/共50頁第四十三頁，共51頁。電場下形成原生質體凝聚體

第44頁/共50頁第四十四頁，共51頁。八.原生質體融合3.電融合技術就是使用電融合儀，其優點在于避免了PEG、高鈣離子，高pH強加于原生質體的生理非常條件，同時融合的條件更加數據化，更便于控制和相互比較。交變電流的強弱、處理時間的長短、電泳沖的大小等因素對融合的效果都有明顯的影響。第45頁/共50頁第四十五頁，共51頁。第46頁/共50頁第四十六頁，共51頁。第47頁/共50頁第四十七頁，共51頁。八.原生質體融合（二）雜種細胞的選擇與細胞雜種的鑒定雜種細胞的選擇方法（1）培養基促進異核體生長的選擇方法（2）葉綠素缺失互補選擇法（3）機械分離，肉眼分辯法（4）雙突變系選擇法（5）熒光標記選擇法第48頁/共50頁第四十八頁，共51頁。八.原生質體融合2.體細胞雜種的鑒定這種鑒定不但在于確認細胞雜種的雜種性，而且必須弄清楚融合親本的雙方各貢獻了哪些遺傳成分，因為在雜種細胞發育成完整植株的過程中，往往有一方的染色體更易消減掉。（1）形態學鑒定（2）細胞學鑒定（3）DNA內切圖譜分析第4