酵母原生質(zhì)體融合生態(tài)學(xué)院生物1120號李香釀酒酵母，又稱面包酵母或出芽酵母。釀酒酵母是與人類關(guān)系最廣泛的一種酵母，廣泛的用于制作面包和饅頭等食品及釀酒，是發(fā)酵中最常用的生物種類。釀酒酵母的細(xì)胞為球形或者卵形，直徑5-10“m。其繁殖的方法為出芽生殖酵母菌種優(yōu)劣直接影響發(fā)酵產(chǎn)品的價(jià)值，在自然界中菌種大多不具有較高的價(jià)值，因而對菌種的選育和改良顯得尤為重要。原生質(zhì)體融合是一項(xiàng)應(yīng)用廣泛的菌種改良技術(shù)。原生質(zhì)體融合(protoplastfusion)是將雙親株的微生物細(xì)胞分別通過酶解脫壁，使之形成原生質(zhì)體，然后在高滲的條件下混合，并加入物理的或化學(xué)的或生物的助融條件，使雙親株的原生質(zhì)體間發(fā)生相互凝集，通過細(xì)胞質(zhì)融合，核融合，進(jìn)而發(fā)生基因組間的交換重組，可以在適宜的條件下再生出微生物的細(xì)胞壁來。從而獲得帶有雙親性狀的、遺傳性能穩(wěn)定的融合子(fusant)的過程［1］。目前常用的融合方法有化學(xué)融合、生物融合、電融合以及激光誘導(dǎo)融合等。本實(shí)驗(yàn)用釀酒酵母2.339與釀酒酵母2.70作為融合雙親，進(jìn)行融合，旨在計(jì)算兩種菌原生質(zhì)體的形成率、再生率及融合率。望能將融合后的原生質(zhì)體應(yīng)用于釀酒生產(chǎn)中以獲得較高的經(jīng)濟(jì)效益。1材料1.1樣品菌種：釀酒酵母(Saccharomgcescerevisiae)的兩種營養(yǎng)缺陷型菌株(女口met-、lys-)。1.2培養(yǎng)基和試劑馬鈴薯培養(yǎng)基：馬鈴薯(去皮)200g，葡萄糖20g，水1000mL。配制方法下：將馬鈴薯去皮，切成約2cm2的小塊，放入1500mL的燒杯中煮沸30min，注意用玻棒攪拌以防糊底,然后用雙層紗布過濾，取其濾液加糖，在補(bǔ)足水分1000Ml,自然pH。YEPD培養(yǎng)基(用于酵母原生質(zhì)體融合)：酵母粉10g，蛋白胨20g，葡萄20g蒸餾水1000mL，pH6.0。YEPD高滲培養(yǎng)基(含0.6mol/LNaCl的YEPD)：在YEPD培養(yǎng)基中0.6mol/LNaCl,3%瓊脂。YNB基本培養(yǎng)基：0.67%酵母氮堿基(YNB，不含氨基算，Difco)，2%葡萄糖，3%瓊脂,pH6.2。另一配方為：葡萄糖10g，(NH4)2SO41g，K2HPO40.125g,(5)KHPO40.875g,KI0.0001g，MgSO4?7H2O0.5g,CaC12?2H2OO.lg，微量元素母液1mL,微生素母液1mL(母液均按常規(guī)配制)，水1000mL，pH5.8~6.0。YNB高滲基本培養(yǎng)基：在YNB基本培養(yǎng)基中加入0.6mol/LNaCl。預(yù)處理液：EDTA-巰基乙醇液，由0.1mol/LEDTA配制成0.4%巰基乙醇。（8）原生質(zhì)融合助融劑：30%PEG6000、0.1mol/LCaC12、pH7.0。⑼去壁酶液：1%蝸牛酶、0.6mol/LNH4C1、50mol/LDTT（二硫蘇糖醇），過濾除菌。（10） 生理鹽水（0.85%NaCl）（11） 0.6mol/LNaCl（三）實(shí)驗(yàn)用具試管、三角瓶、搖床、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴鍋、離心機(jī)、接種環(huán)、移液管、酒精燈、分光光度計(jì)。2實(shí)驗(yàn)方法2.1原生質(zhì)體的制備2.1.1收集菌體從斜面上取兩親本菌株各一環(huán)酵母菌分別接種于5mL含有YEPD液體培養(yǎng)基的試管中，30°C靜置培養(yǎng)24h后，取0.3?0.5mL轉(zhuǎn)接至裝有50mL新鮮YEPD培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，搖床30°C培養(yǎng)至對數(shù)早期（14?16h），細(xì)胞數(shù)達(dá)107-108/mL。離心（4000r/min,10min）收集菌體。2.1.2菌體的預(yù)處理菌體用生理鹽水洗兩次（離心條件同前），去上清液后，于離心管中加入預(yù)處理液（其用量約為每克濕重菌體用4mL處理液），30C，30min，離心（1000r/min），10min,取沉淀物。2.1.3酶液處理去壁于上述離心管中加入新鮮配制的酶液5?10mL（酶液用量約為1%?2%），輕輕搖動(dòng)，懸浮細(xì)胞，然后于30C搖床輕輕振蕩（100r/min）培養(yǎng)50~60min,每隔20min取樣于相差顯微鏡下觀察，繪圖并計(jì)數(shù)原生質(zhì)體的形成率（按下列公式計(jì)算）。待90%以上細(xì)胞都形成原生質(zhì)體后，離心（2000r/min,5min）去除酶液，并用0.6mol/LNaCl洗滌兩次（離心條件同上），用4mL0.6mol/LNaCl將原生質(zhì)體制成懸液，備用。原生質(zhì)體形成率=［原生質(zhì)體數(shù)/（原生質(zhì)體數(shù)+完整細(xì)胞數(shù)）］*100%2.2原生質(zhì)體的再生將原生質(zhì)體包埋于半固體瓊脂中，并傾注于再生基本培養(yǎng)基上，這是雙層培養(yǎng)法，可大大提高原生質(zhì)體再生率。首先在培養(yǎng)皿中鋪一底層含瓊脂2.5%的高滲YEPD再生培養(yǎng)基，放溫箱中烘數(shù)小時(shí)，使其表面脫水。然后將10mL預(yù)先保溫在40C，含有0.5%瓊脂并混合了1mL原生質(zhì)體懸液的YEPD高原生生培養(yǎng)基倒入至底層平板中制成雙層平板。亦可用涂布法，將純化的原生質(zhì)體懸液，適當(dāng)稀釋后，各取0.2mL，涂于含有2.5%瓊脂的20mL高滲YEPD再生培養(yǎng)基上，對照用無菌水稀釋原生質(zhì)體，均勻涂布于YEPD表面。30C培養(yǎng)48h，分別記錄長出的菌落數(shù)，并按以下公式計(jì)算出原生質(zhì)體的再生率。原生質(zhì)體再生率=［（高滲YEPD長出的菌落數(shù)-對照YEPD長出的菌落數(shù)）/顯微鏡計(jì)數(shù)的原生質(zhì)體數(shù)］X100%2.3原生質(zhì)體的融合2.3.1加入助融劑將雙親原生質(zhì)體懸液（5x107?10x107個(gè)/mL）各3mL混合，離心（3000r/min,10min）棄上清后，加入3mL助融劑，輕輕振蕩，懸浮原生質(zhì)體并置30°C恒溫水浴保溫20min。每隔3~4min輕輕搖動(dòng)一次，使助融劑與原生質(zhì)體充分接觸，然后立即加入10mL高滲YEPD培養(yǎng)基，離心（6000r/min，10min），棄上清液可獲得融合沉淀物（即原生質(zhì)體融合物）。2.3.2稀釋及涂布用0.6mol/LNaCl懸浮以上獲得的原生質(zhì)體融合物，并進(jìn)行稀釋至10-3，分別從10-210-3中取100?卩L,涂于YNB基本培養(yǎng)基平板上。2.3.3選擇融合子及計(jì)算融合頻率將以上培養(yǎng)物于30°C培養(yǎng)3~5d，從長出的菌落中選出融合子。并同時(shí)在基本培養(yǎng)基上作單獨(dú)親本株的原養(yǎng)型回復(fù)突變。另取等量稀釋液用相同方法于再生完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，并計(jì)算菌落數(shù)。以上是測定融合頻率的涂布法。亦可用雙層平板法，首先在培養(yǎng)皿鋪一層含瓊脂2.5%的高滲YEPD再生培養(yǎng)基，制成底層平板，放溫箱中烘數(shù)小時(shí)，使其表面脫水。然后將10ml預(yù)先保溫在50C下，并混合了0.1mL原生質(zhì)體融合物的YNB高滲基本培養(yǎng)基倒入至底層平板中，制成雙層平板，同涂布法，置30C培養(yǎng)3~5d，從長出的菌落中選出融合子。按下列公式計(jì)算融合頻率：融合頻率=［（融合子數(shù)*稀釋倍數(shù)）/（再生培養(yǎng)基上生長的總菌落數(shù)*稀釋倍數(shù)）］*100%3實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析3.1原生質(zhì)體形成率用新鮮制備的去壁酶液5ml,輕輕搖動(dòng)，然后于30C搖床振蕩培養(yǎng)50min,根據(jù)2.1.3原生質(zhì)體的形成率計(jì)算公式，結(jié)果如表1.1所示。酶液處理后，原生質(zhì)體形成率分別達(dá)到91.30%和96%，,其中釀酒酵母2.339的原生質(zhì)體形成率較高，說明酶液的水解細(xì)胞壁效果對酵母2.339的效果更為理想，有利于下一步原生質(zhì)體融合。表一原生質(zhì)體形成率結(jié)果釀酒酵母菌株原生質(zhì)體數(shù)完整細(xì)胞數(shù)原生質(zhì)體形成率2.706.30*1086.90*10891.30%2.3391.92*1092.00*10996.00%3.2原生質(zhì)體再生率將雙親原生質(zhì)體懸液分別用0.6mol/LNaCl稀釋至10-5，用0.2ml涂布于YEPD高滲和YEPD培養(yǎng)基中。30C培養(yǎng)48h,分別記錄長出的菌落數(shù)，并用2.2中公式計(jì)算出原生質(zhì)體

的再生率。其結(jié)果如表二所示。從表中可知，原生質(zhì)體的再生率較低，可能是由于培養(yǎng)基的配制不規(guī)范，導(dǎo)致原生質(zhì)體的再生不理想。表二原生質(zhì)體再生率結(jié)果釀酒酵母菌株YEPD中的平均菌落數(shù)YEPD高滲長出的平均菌落數(shù)顯微鏡計(jì)數(shù)的原生質(zhì)體數(shù)原生質(zhì)體再生率2.70132746.30*1084.14%2.3391386061.92*1092.44%3.3原生質(zhì)體的融合率將處理后的原生質(zhì)體融合物，稀釋至10-2、10-3，涂布于YNB和YEPD高滲培養(yǎng)基上3d后計(jì)算菌數(shù)，結(jié)果如表三所示。結(jié)果顯示，稀釋倍數(shù)為10-2時(shí)，培養(yǎng)基上菌落連成菌苔無法計(jì)數(shù)。10-3稀釋倍數(shù)下，YNB培養(yǎng)基上菌數(shù)生長茂密，但仍可計(jì)數(shù)。表三原生質(zhì)體融合率結(jié)果稀釋倍數(shù)YEPD稀釋倍數(shù)YEPD高生長菌落數(shù)YNB生長菌落數(shù)融合頻率10-2無法計(jì)數(shù)無法計(jì)數(shù)/10-3442188423.46%4討論原生質(zhì)體融合方法多樣，基本的有化學(xué)法和物理法［2］。常見的化學(xué)法有PEG結(jié)合Ca2+、PH誘導(dǎo)法。化學(xué)方法的優(yōu)點(diǎn)是不需要特別的儀器，操作簡單，但其化學(xué)物質(zhì)存在一定的毒性，融合率不高。物理方法有電融法和激光誘導(dǎo)融合法。電融合法的有無毒、直觀、融合效率高等優(yōu)點(diǎn)。激光誘導(dǎo)融合法毒性小，損傷小，但由于設(shè)備復(fù)雜，操作難度大，融合率低等缺點(diǎn)難以大范圍使用，尚處在發(fā)展階段。本實(shí)驗(yàn)采用化學(xué)方法，得到的原生質(zhì)體融合率為23.46%，根據(jù)王娟娟的等人的研究，采用電融合技術(shù)，添加PEG助融劑可使雙親融合率達(dá)到70%-80%,融合率極高，可見，本次試驗(yàn)中融合率較低，有待進(jìn)一步完善。實(shí)驗(yàn)中，兩種酵母的原生質(zhì)體再生率很低，可能是由于YEPD及YEPD高滲培養(yǎng)基的配制不規(guī)范，導(dǎo)致培養(yǎng)基中成分改變，不符合原生質(zhì)體再生的培養(yǎng)條件，導(dǎo)致