1、實(shí)驗(yàn)一、外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離 單個(gè)核細(xì)胞：一、基本原理?常用哪些方法分離細(xì)胞，免疫學(xué)可采用哪些方法本實(shí)驗(yàn)是利用不同的細(xì)胞之間密度不同的性質(zhì)，通過(guò)速度沉降法來(lái)分離制備外周血中單個(gè)核細(xì)胞。二、操作：1、稀釋血：1ml血+1ml緩沖液（含510IU/ml肝素的PBS，無(wú)血清 ）（用滴管）實(shí)驗(yàn)一、外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離 單個(gè)核細(xì)胞：離心單個(gè)核細(xì)胞（斜面！）2、加于淋巴細(xì)胞分離液上層，離心：500g 20min（小于1000rpm)！沿管壁滴加 !淋巴細(xì)胞分離液取法3、吸出細(xì)胞，懸于營(yíng)養(yǎng)緩沖液（12倍量含5IU/ml肝素、2滅活小牛血清的PBS液 ），離心：200g 10min，除去血小板。4、洗滌：

2、同樣營(yíng)養(yǎng)液洗滌2次，洗去淋巴細(xì)胞分離液，離心： 500g 10min離心單個(gè)核細(xì)胞2、加于淋巴細(xì)胞分離液上層，離心：500g 25、檢查細(xì)胞存活率：（1）將1滴細(xì)胞懸液和1滴臺(tái)盼蘭混勻，靜置5-10分鐘。（2）上述混合液滴入細(xì)胞計(jì)數(shù)板，在顯微鏡下觀察細(xì)胞，計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)和死細(xì)胞數(shù)。三、注意事項(xiàng)：1。血液制品2。注意將稀釋后的血輕輕地沿管壁鋪在細(xì)胞分離液上，避免破壞其界面。 3。在收集單個(gè)核細(xì)胞時(shí)，預(yù)先將毛細(xì)滴管中的氣體排空，再將毛細(xì)滴管輕輕插入單個(gè)核細(xì)胞層，沿管壁輕輕旋轉(zhuǎn)吸取細(xì)胞，千萬(wàn)不能吹打，以免影響細(xì)胞的收集效果。 5、檢查細(xì)胞存活率：4。抽血后在2小時(shí)內(nèi)使用。*關(guān)于實(shí)驗(yàn)報(bào)告：全部?jī)?nèi)容都要填

3、寫(xiě)，關(guān)于日期。報(bào)告你的細(xì)胞收率 ，存活率。4。抽血后在2小時(shí)內(nèi)使用。實(shí)驗(yàn)二、酶聯(lián)免疫檢測(cè)技術(shù)（ELISA） 一、實(shí)驗(yàn)原理： 酶聯(lián)免疫測(cè)定法實(shí)質(zhì)上是將專一性很強(qiáng)的、十分靈敏的、能夠定量進(jìn)行的抗原抗體結(jié)合反應(yīng)與高催化效能的酶促反應(yīng)偶聯(lián)在一起的一種分析方法。它除了用來(lái)測(cè)定抗體外，原則上適用于一切可以誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生相應(yīng)抗體的抗原和半抗原物質(zhì)的測(cè)定。其特點(diǎn)是專一性強(qiáng)，靈敏度高，操作簡(jiǎn)便，無(wú)須特殊設(shè)備，特別適用于測(cè)定成分復(fù)雜的體液及組織中的微量生命物質(zhì)，而且?guī)缀醪皇芷渌镔|(zhì)的干擾。 實(shí)驗(yàn)二、酶聯(lián)免疫檢測(cè)技術(shù)（ELISA） 一、實(shí)驗(yàn)原理：一、原理（續(xù)）測(cè)定方法：酶聯(lián)免疫測(cè)定法應(yīng)用非常廣泛。具體操作方法隨測(cè)定對(duì)

4、象及測(cè)定要求的不同而有很大差異。液相固相吸附測(cè)定法酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)簡(jiǎn)稱酶標(biāo)法。酶標(biāo)法的基本測(cè)定方法有三類：即間接法(抗原-抗體-酶標(biāo)抗抗體)雙抗體(夾心)法(抗體-抗原-酶標(biāo)抗體)抗原競(jìng)爭(zhēng)法。 一、原理（續(xù)）測(cè)定方法：本次實(shí)驗(yàn)檢測(cè)血清IgG，應(yīng)用的是雙抗體夾心法。 本次實(shí)驗(yàn)檢測(cè)血清IgG，應(yīng)用的是雙抗體夾心法。 二、實(shí)驗(yàn)方法：1、包被抗體： 包被抗體濃度為：用包被液稀釋（包被聚苯乙烯要在偏堿性條件下進(jìn)行，所以該包被液用pH9.6的碳酸鹽緩沖溶液）抗體至10或20ug/ml，每孔加100ul。加18孔18孔的安排：套上包裝袋，4過(guò)夜，棄上清，以洗滌液(200ul)洗滌三次，甩干。

5、關(guān)于對(duì)照、平行！標(biāo)準(zhǔn)：S1-S5ELISA熒光免疫空白對(duì)照陰性對(duì)照陽(yáng)性對(duì)照二、實(shí)驗(yàn)方法：1、包被抗體： 包被抗體濃度為：用2、加抗原：！稀釋抗原用加BSA的保溫液稀釋！如上頁(yè)圖所示，加抗原，空白和熒光陰性對(duì)照加含BSA的保溫液標(biāo)準(zhǔn)抗原1-5的濃度分別為：50，100，200，300，500ng/ml(都從500ng/ml加，分別加10，20，40，60，100ul至各孔，再分別補(bǔ)加90，80，60，40，0ul保溫液即可)熒光各孔：陰性對(duì)照：Ab-Ag-FITC-Ab，陽(yáng)性對(duì)照用200ng/ml，500ng/ml37，1hr，洗滌液洗滌三次2、加抗原：3、加酶標(biāo)抗體、熒光標(biāo)記抗體：所有ELIS

6、A各孔均加100ul（已稀釋好,稀釋倍數(shù)：2000各熒光孔不加酶標(biāo)抗體，加熒光標(biāo)記抗體100ul,(已稀釋好，稀釋倍數(shù)：50)！注意！熒光怕見(jiàn)光，注意避光，加液、保溫時(shí)都要避光37，45min，取出后保溫平衡10分鐘,洗滌液洗滌三次，熒光各孔可不洗3、加酶標(biāo)抗體、熒光標(biāo)記抗體：4、觀察熒光、ELISA各孔加底物：一組同學(xué)觀察熒光、一組同學(xué)加酶底物。酶底物溶液要現(xiàn)配，由老師或同學(xué)代表配制一份即可。各孔加100ul，37保溫15min。終止酶反應(yīng)：各孔加4mlol/L硫酸50ul終止。5、酶標(biāo)儀上測(cè)各孔492nm的光吸收。打印直線附在實(shí)驗(yàn)報(bào)告上！4、觀察熒光、ELISA各孔加底物：實(shí)驗(yàn)三、納米金免

7、疫檢測(cè)技術(shù)一、實(shí)驗(yàn)原理：以雙抗體夾心法為例。在硝酸纖維素膜的膜片上滴加純化的抗體，為膜所吸附。當(dāng)?shù)渭釉谀ど系臉?biāo)本液體滲濾過(guò)膜時(shí)，標(biāo)本中含抗原被膜上抗體捕獲，其余無(wú)關(guān)蛋白等濾出膜片。其后加入的膠體金標(biāo)記的抗體也在滲濾中與已結(jié)合在膜上的抗原相結(jié)合。因膠體金本身呈紅色，陽(yáng)性反應(yīng)即在膜中央顯示紅色斑點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)三、納米金免疫檢測(cè)技術(shù)一、實(shí)驗(yàn)原理：一、實(shí)驗(yàn)原理本實(shí)驗(yàn)不用夾心法，直接加抗原，再加金標(biāo)抗體。一、實(shí)驗(yàn)原理本實(shí)驗(yàn)不用夾心法，直接加抗原，再加金標(biāo)抗體。二、實(shí)驗(yàn)操作：點(diǎn)加抗原：（人IgG）：在硝酸纖維素膜下墊吸水材料（衛(wèi)生紙），用微量移液器取3ul抗原溶液點(diǎn)于硝酸纖維素膜上，注意點(diǎn)樣時(shí)要逐次點(diǎn)于膜上，待

8、前次所點(diǎn)液體滲入后再繼續(xù)點(diǎn)，不要使斑點(diǎn)太大，同時(shí)注意不要太用力將膜點(diǎn)破，致使斑點(diǎn)太大。 烤干或吹干，保證抗原能夠吸附到膜上，給蛋白質(zhì)一定吸附時(shí)間，否則下步的洗滌有可能將蛋白洗掉！）。洗滌、封閉：點(diǎn)加10ul 含1%BSA的PBS洗滌（BSA作用是封閉），待干（注意別讓BSA覆蓋前一步抗原），另點(diǎn)1個(gè)點(diǎn)（作為陰性對(duì)照）。二、實(shí)驗(yàn)操作：點(diǎn)加抗原：（人IgG）：在硝酸纖維素膜下墊吸點(diǎn)加金標(biāo)抗體：金標(biāo)記抗體稀釋至1：25-1：50，點(diǎn)加10ul，即可在陽(yáng)性對(duì)照點(diǎn)處觀察到紅色斑點(diǎn)，而陰性對(duì)照則無(wú)。點(diǎn)加金標(biāo)抗體：金標(biāo)記抗體稀釋至1：25-1：50，點(diǎn)加10三、注意事項(xiàng)：1斑點(diǎn)大小控制。2勿用力戳破膜。3給第一抗體和封閉蛋白（BSA）一定吸附時(shí)間。4把你的實(shí)驗(yàn)結(jié)果粘貼于實(shí)驗(yàn)報(bào)告上，報(bào)告測(cè)定結(jié)果，指出陽(yáng)性點(diǎn)和陰性點(diǎn)。三、注意事項(xiàng)：1斑點(diǎn)大小控制。實(shí)驗(yàn)四、免疫熒光檢測(cè)技術(shù)一、基本原理：熒光雙抗夾心法定位與定量抗原二、操作： 1、抗體包被：（同實(shí)驗(yàn)二）2、加樣本：同實(shí)驗(yàn)二，但在本實(shí)驗(yàn)中不做標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品加兩個(gè)稀釋濃度，如1：20，1：40，另外加一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照（用人IgG標(biāo)準(zhǔn)），每孔做一個(gè)復(fù)孔，加空白對(duì)照共計(jì)8孔。3、加熒光抗體：從這里開(kāi)始與實(shí)驗(yàn)二不同之處是一定要記得避光操作。按照要求加入一定稀釋度的熒光標(biāo)記抗人IgG抗體（一