1、高效液相色譜法測定雙黃連粉針劑中綠原酸和黃芩苷的含量【關鍵詞】雙黃連粉針劑；,綠原酸；,黃芩苷；,高效液相色譜法；,梯度洗脫摘要：目的建立高效液相色譜HPL法同時測定雙黃連粉針劑中綠原酸和黃芩苷外標定量測定方法。方法用自制813混合型烷基鍵合硅膠柱(5，4.6150)為固定相，甲醇和水溶液用磷酸調pH2.7為流動相，在813柱上梯度洗脫，流速為1lin-1，紫外檢測波長為323n。結果綠原酸和黃芩苷的線性范圍分別為4.0100.0gl-1和8.6215.0gl-1；相關系數分別為0.99989和0.99997；加樣回收率分別為100.53%和99.94%；檢測限分別為0.014gl-1和0.0

2、20gl-1；精細度實驗RSD分別為1.12%和0.61%；重現性實驗RSD分別為1.14%和0.73%，穩定性實驗RSD分別為0.89%和0.54%；4批樣品中綠原酸的含量在1.5771.753gl-1，黃芩苷的含量在26.0228.68gl-1。結論該方法簡便，快速，準確，靈敏度高，重現性好，本錢低，可用于雙黃連粉針劑的質量控制。關鍵詞：雙黃連粉針劑；綠原酸；黃芩苷；高效液相色譜法；梯度洗脫QuantitativeDeterinatinfhlrgeniAidandBaialininShuanghuanglianPderInjetinbyHPLAbstrat：bjetiveTdevelpan

3、RP-HPLethdfrthedeterinatinfhlrgeniaidandbaialininShuanghuanglianpderinjetin.ethdsA813ixedalkyl(5，4.6150)bndsiliafrreversed-phaseHPLasprepared.ThebilephaseasH3Hphsphriaidslutin(pH2.7).Theflrateassetat1.0l/in.Thedetetinavelengthasat323n.hlrgeniaidandbaialinereseparatedbyHPLithgradeelutin.ResultsThelin

4、earityrangesfhlrgeniaidandbaialinere4.0100.0g/land8.6215.0g/lrespetively，therrelatineffiientsere0.99989and0.99997,theaveragereveriesfaddingsapleere100.53%and99.94%,detetinliitsere0.014g/land0.020g/l,theRSD(n=5)feasureentpreisintestere1.12%and0.61%,theRSD(n=5)freprduibilitybeteentestsere0.89%and0.54%

5、.ThententfhlrgeniaidinShuanghuanglianpderas1.5771.753g/l，andthatfbaialinas26.0228.68g/l.nlusinTheethdissiple,fast,aurate，sensitive,reprduibleandlst.ItisfitfrthequalityntrlfShuanghuanglianpder.Keyrds：Shuanghuanglianpder;hlrgeniaid;Baialin；HPL雙黃連粉針劑是供注射用的中藥制劑，由金銀花、黃芩和連翹組成，具有清熱解毒、辛涼解表的功能。主要成分為綠原酸、黃芩苷，質

6、量控制多采用黃芩苷和綠原酸作為指標。含量測定方法有紫外分光光度法1，2、高效毛細管電泳3，4及高效液相色譜法59等。由于該制劑成分中黃芩苷和綠原酸極性相差較大,故質量標準中規定分別測定二者含量。本實驗采用自制813混合型烷基鍵合硅膠柱10，利用梯度洗脫，逐漸降低流動相極性的方法不經別離同時測定四批樣品中綠原酸和黃芩苷的含量，以期為該制劑的含量的質量控制提供參考。1器材1.1儀器KNAUER高效液相色譜儀德國由K-501HPL泵、分析型動態混合器、K-2600UVDetetr、7725i手動進樣閥、Eerhr2000BasiEditin色譜工作站軟件V2.05和T3000柱溫箱北京創新通恒科技組

7、成。KQ-400BD型數控超聲波清洗器昆山市超聲儀器，813混合型烷基鍵合硅膠色譜柱自制，PHS-3精細pH計上海雷磁儀器廠，TU-1900光度掃描儀。1.2藥品與試劑雙黃連粉針劑哈爾濱醫藥股份，批號0010207，0306201，0402205，0402206；綠原酸對照品中國藥品生物制品鑒定所消費，批號110753-200212；黃芩苷對照品中國藥品生物制品鑒定所，批號110715-200212；甲醇色譜純，上海化學試劑，磷酸分析純，重蒸餾水。2方法與結果2.1混合型烷基鍵合硅膠的制備2.0g經6lL-1Hl活化后的枯燥硅膠，懸浮在80l無水甲苯中，參加2.0l813烷基三乙氧基硅烷和3滴

8、三乙胺，在氮氣氣氛中，120加熱攪拌反響24h，待冷至室溫后，抽濾，分別用甲苯、乙醚、丙酮、甲醇、水洗滌屢次，120下真空枯燥2h后稱重，得約2.2g固定相。813混合烷基三乙氧基硅烷是一種石油尾氣中的混合烯烴硅氫加成得到的廉價的偶聯劑。2.2流動相的制備流動相A：測試前，甲醇R用G4玻璃漏斗過濾，然后超聲30in，冷卻后供測試用；流動相B：取適量重蒸餾水至500l燒杯中，通過酸度計和電磁攪拌器，用H3P4(AR)-H219，v/v溶液調pH2.7，以下操作同流動相A。2.3對照品儲藏液的制備精細稱取黃芩苷對照品21.5g，綠原酸對照品10.0g，分別置50l棕色量瓶中，用甲醇-水(11,v/

9、v)溶解定容至50l，分別配制成濃度為0.43gl-1和0.20gl-1的貯備液，綠原酸置冰箱低溫保存。2.4樣品溶液及空白對照液的制備精細稱取雙黃連粉針劑15g置50l棕色容量瓶中，參加甲醇-水(11,v/v)適量，超聲溶解20in，冷卻，用甲醇-水(11,v/v)稀釋至刻度，搖勻，以3000rin-1的轉速離心20in后，用0.45過濾膜過濾，供測試用。另取處方中除金銀花、黃芩的其余藥材，按規定工藝制備成雙黃連粉針劑后，依樣品溶液制備方法制成空白液。轉貼于論文聯盟.ll.2.5色譜別離檢測條件2.5.1波長的選擇對照品中綠原酸和黃芩苷用TU-1900型紫外分光光度計進展紫外掃描，綠原酸在3

10、23n處有較強的吸收，而黃芩苷在275n處有較強吸收,317n有次強吸收。但由于綠原酸在樣品中含量較低，而黃芩苷在樣品中含量較高約為綠原酸的15倍，為了進步綠原酸檢測靈敏度，應選323n作為測定波長。2.5.2流動相的組成及酸度的選擇在流動相的pH值固定不變時，被別離組分隨梯度起始甲醇含量的下降而逐漸分開，當梯度起始甲醇含量從25%eH-H2,v/v繼續下降時，色譜峰變寬，柱效下降，別離效果變差，因此，固定梯度起始甲醇含量為25%eH-H2,v/v。在流動相梯度固定不變時，改變pH值，色譜峰隨pH值下降變窄，柱效進步，保存時間縮短，別離效果進步，當pH值下降到2.7時，待測組分與其他組分實現基

11、線別離，因此，固定流動相的pH值為2.7。2.5.3色譜別離條件及色譜別離圖色譜柱為813混合烷基鍵合相5，4.6150，流動相：A：甲醇，B：水用磷酸調至pH2.7，梯度洗脫：07in，A25%，79in，A25%40%，915in，40%50%，流速1lin-1，柱溫：30，檢測波長：323n，進樣量20l。在上述優化的色譜條件下得色譜別離圖見圖1。對照品中綠原酸和黃芩苷的保存時間分別為6.030，17.749in；拖尾因子分別為1.033，1.115；柱效分別為14198，242834。樣品中綠原酸和黃芩苷的保存時間為6.033，17.750in，拖尾因子分別為1.054，1.158，柱

12、效分別為14198，242834，待測組分與鄰近組分到達了基線別離。2.6方法學考察2.6.1線性關系考察及檢出限精細稱取上述貯備液各0.2，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0，3.0，4.0，5.0l至10l容量瓶中，用甲醇-水11,v/v稀至刻度，搖勻，用0.45微孔過濾膜過濾后，按上述色譜條件進展測定。以標準物的峰面積為A為縱坐標,標準溶液濃度()為橫坐標,得綠原酸和黃芩苷的線性回歸方程：A=-0.15083+1.01463，r=0.99989A=-0.45437+0.59963，r=0.99997結果說明:綠原酸在4.0100.0gl-1濃度范圍內呈線性關系，黃芩苷在8.6215.

13、0gl-1濃度范圍內呈線性關系。按信噪比31計，綠原酸和黃芩苷的檢出限分別為0.27ng和0.39ng。2.6.2樣品的測定按上述測定條件對“2.4項下的樣品溶液進展測定。分別由線性回歸方程求得綠原酸和黃芩苷的濃度。結果見表1。a-綠原酸對照品；b-黃芩苷對照品；-樣品；1-綠原酸；2-黃芩苷;d-空白樣品圖1雙黃連粉針劑對照品和空白樣品的色譜別離圖略表1樣品含量測定結果略2.6.3回收率實驗精細稱取含量的雙黃連粉針劑批號：040220614.8g兩份于2個50l棕色容量瓶，參加甲醇-水11,v/v適量，超聲溶解20in，冷卻，分別參加綠原酸0.40，0.60，0.8l，黃芩苷0.40，0.6

14、0，0.8l，再用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45微孔過濾膜過濾后，按上述色譜條件測定。結果見表3。表2綠原酸及黃芩苷回收率測定結果略2.6.4精細度實驗分別精細汲取綠原酸和黃芩苷對照品溶液1.2l，用50%的甲醇稀至10l容量瓶中搖勻，用0.45微孔過濾膜過濾后，按上述色譜條件下，日內重復測定5次，日間重復測定5次，日內測定綠原酸的平均峰面積為25.0213，RSD為1.12%；測定黃芩苷的平均峰面積為30.3104，RSD為0.61%。日間測定綠原酸的平均峰面積為24.6852,RSD為1.73%，黃芩苷的平均峰面積為為29.7034，RSD為0.71%。結果見表3。表3精細度實驗測

15、定結果略2.6.5重現性實驗取同一批號0402206雙黃連粉針劑5份，按樣品測定項下測定，5份雙黃連粉針劑中，綠原酸的測定結果分別是1.727%，1.710%，1.723%，1.728%，1.740%，平均含量為1.726%，RSD=0.52%，黃芩苷的測定結果分別是26.36%，26.09%，26.30%，26.26%，26.29%，平均含量為26.26%，RSD=0.39%。2.6.6穩定性實驗精細汲取樣品溶液批號0402206，按“2.5項下測定，分別在0，2，4，6，8，10，12h測定綠原酸和黃芩苷的峰面積，其RSD分別為0.82%和1.02%，說明至少在12h內可進展準確的定量分析

16、。3討論從表1可知，不同廠家不同批號的雙黃連粉針劑中綠原酸和黃芩苷的含量各不一樣，黃芩苷的測定與?中國藥典?方法進展比擬，兩種方法測定的結果非常吻合，但藥典方法只能單一測定黃芩苷的含量，不能同時測定黃芩苷和綠原酸的含量。為了保證其質量，選擇一種簡便、快速、準確的定量方法控制其質量是至關重要的。文獻6，7也是采用高效液相法同時測定兩種組分，但均為進口DS柱，價格比擬昂貴。本方法采用813混合烷基三乙氧基硅烷和自制球型硅膠合成了混合型烷基鍵合相液相色譜固定相，價格低廉，利用梯度洗脫兩種組分也得到很好的別離，且方法簡單，結果準確，說明可用廉價的813柱代替較昂貴DS柱，對雙黃連粉針劑的質量進展控制，

17、具有實際意義。參考文獻：1李茂森.一階導數光譜法測定雙黃連口服液中黃芩苷的含量J.基層中藥雜志，1996，102：32.2欒士香.系數倍率法測定雙黃連注射液中黃芩苷、綠原酸、連翹甙的含量J.中國中藥雜志，1991，1610：602.3程智勇，韓鳳梅，蔡敏，等.HPE法測定雙黃連口服液中黃芩苷和綠原酸的含量J.藥學學報,1999，3411：854.4鄭一寧，謝天堯，莫金垣，等.雙黃連粉針劑中黃芩苷的高效毛細管電泳-電導法測定J.分析測試學報，2001，206：21.5華菊根，胡立君，李國忱.注射用雙黃連質量標準的研究J.中成藥，1996，1811：13.6馬洪波，鄧光瑞，李興斌，等.改良HPL法測定雙黃連粉針劑