1、骨髓間質(zhì)干細(xì)胞與型膠原修飾的 PLGA黏附性的觀察【關(guān)鍵詞】骨髓間質(zhì)干細(xì)胞PLGA組織工程Keyrds：bnearresenhyalsteell;PLGA;tissueengineering組織工程修復(fù)受損組織的根本方法就是將種子細(xì)胞種植于生物支架材料上，經(jīng)體外培養(yǎng)一定時(shí)間后再植入體內(nèi)到達(dá)修復(fù)和重建受損組織的目的，所以細(xì)胞與生物支架材料的黏附性就成了構(gòu)建組織工程化組織和器官的關(guān)鍵問(wèn)題之一。本研究將體外提純，擴(kuò)增的BSs種植到經(jīng)型膠原修飾的PLGA材料上結(jié)合培養(yǎng)，掃描電鏡觀察其黏附情況，觀察型膠原修飾的PLGA材料的細(xì)胞親和性，探究以BS為種子細(xì)胞，以型膠原修飾的PLGA為生物支架材料構(gòu)建組織工

2、程的可行性，為臨床組織工程的應(yīng)用研究提供理論和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。1材料和方法1.1材料和儀器SD大鼠(廣東省動(dòng)物中心)；PLGA(濟(jì)南邁康公司，分子量10萬(wàn)單位)；胎牛血清(FBS)、淋巴細(xì)胞別離液(天津TBD公司)；DE(Dulbediniuessentialediu)干粉培養(yǎng)基、胰蛋白酶、型膠原(Siga公司)；流式細(xì)胞儀FASAria(美國(guó)BD公司)；D29FIT、D44FIT、D106PE、D34PE和D45FIT(Anell公司)；PI(Siga公司)；掃描電鏡(日立公司，日本)。1.2PLGA的制備合成及掃描電鏡觀察7025的PLGA溶解于二氧六環(huán)勻速攪拌3h，溶液澆鑄平皿上，-20放置過(guò)

3、夜，放入質(zhì)量比為3070的酒精溶液中萃取8h，連續(xù)3次，將結(jié)塊樣品放入真空機(jī)冷凍枯燥。制備成10105大小的樣品，將上述得到的樣品10個(gè)放入含5g型膠原的5lPBS溶液中振蕩混合1h，入真空機(jī)冷凍枯燥。質(zhì)量法測(cè)定其孔隙率1。取小塊PLGA材料，固定于2的戊二醛24h，0.1l/LPBS(pH7.2)洗3次，不同梯度酒精逐級(jí)枯燥，樣品鍍金，電鏡掃描。1.3BSs的體外培養(yǎng)1個(gè)月齡SD大鼠，脫頸處死，取雙側(cè)股骨，剔凈軟組織，75酒精浸泡消毒5in，PBS洗2次，剪斷股骨一端后，用帶5號(hào)針頭的注射器將體積分?jǐn)?shù)為10胎牛血清的DE(含100Ul青霉素、100gl鏈霉素和20Ul肝素)沖洗股骨骨髓腔，取

4、混合骨髓液4l緩慢注入事先準(zhǔn)備好的含6l的淋巴細(xì)胞別離液的離心管內(nèi)，800g離心20in，取出中間層的單核細(xì)胞接種于252培養(yǎng)瓶，37、52培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。5d后首次換液，以后每隔3d換液，長(zhǎng)滿后傳代，取P3細(xì)胞進(jìn)展實(shí)驗(yàn)。1.4BSs的形態(tài)學(xué)觀察原代及傳代培養(yǎng)的細(xì)胞，用倒置相差顯微鏡逐日觀察細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖情況及形態(tài)特征。1.5BSs的鑒定FAS檢測(cè)BSs的外表抗原，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的P細(xì)胞消化別離(37，35in)，搜集細(xì)胞制成1106個(gè)細(xì)胞l的細(xì)胞懸液。參加500l適當(dāng)稀釋度的FIT標(biāo)記抗人D29、D44、D45單克隆抗體，PE標(biāo)記抗人D34和D106單克隆抗體，反響30in后檢測(cè)。1.6BSs

5、的生長(zhǎng)曲線，細(xì)胞周期及活力的檢測(cè)取P1、P3、P5的細(xì)胞以104個(gè)細(xì)胞l接種于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，每天同一時(shí)間消化3孔計(jì)數(shù)，連續(xù)計(jì)數(shù)8d繪制生長(zhǎng)曲線。搜集P3細(xì)胞，制成1106個(gè)細(xì)胞l的細(xì)胞懸液，F(xiàn)AS對(duì)BSs的細(xì)胞活力和細(xì)胞周期進(jìn)展檢測(cè)。1.7BSs與型膠原修飾的PLGA復(fù)合取P3細(xì)胞，調(diào)整濃度為106個(gè)細(xì)胞l。已制作好的支架材料經(jīng)60消毒后用無(wú)菌DE培養(yǎng)基反復(fù)沖洗，培養(yǎng)箱內(nèi)晾干，把PLGA放于24孔板的孔底，滴加100l的細(xì)胞懸液，培養(yǎng)1h后翻轉(zhuǎn)，再在另一面滴加100l細(xì)胞懸液，培養(yǎng)1h后加培養(yǎng)基吞沒(méi)整個(gè)基質(zhì)材料，每周換液2次，體外培養(yǎng)2周，分別在復(fù)合后1、7、14d取材，作掃描電鏡觀察。2結(jié)

6、果2.1型膠原修飾的PLGA掃描電鏡觀察合成的復(fù)合PLGA為多孔的三維立體構(gòu)造，電鏡掃描可見(jiàn)：PLGA內(nèi)部形成大小不一的大孔和互連的小孔，彼此互相交通，支架四處均可見(jiàn)白色的微小型膠原顆粒(圖1)。應(yīng)用質(zhì)量法測(cè)得的孔隙率為90，孔徑在50200之間，平均孔徑為100。2.2BSs形態(tài)學(xué)觀察原代細(xì)胞的觀察：剛接種的細(xì)胞呈球形懸浮于培養(yǎng)液中，810h開(kāi)場(chǎng)逐漸沉降貼壁，48h少數(shù)貼壁細(xì)胞呈成纖維細(xì)胞樣外形，35d貼壁細(xì)胞開(kāi)場(chǎng)增殖呈克隆生長(zhǎng)，57d后局部細(xì)胞成細(xì)胞團(tuán)簇，細(xì)胞多為梭形，胞核明顯為卵圓形或圓形。可見(jiàn)13個(gè)核仁，胞質(zhì)豐富、胞漿明晰。原代培養(yǎng)12d可長(zhǎng)滿瓶底。培養(yǎng)液中的渣滓隨換液被逐漸去除。轉(zhuǎn)貼

7、于論文聯(lián)盟.ll.傳代細(xì)胞的觀察：傳代后的細(xì)胞增殖迅速，24h開(kāi)場(chǎng)貼壁，68h貼壁根本完全，于3d細(xì)胞數(shù)量開(kāi)場(chǎng)明顯增多，56d可長(zhǎng)滿瓶底，交融成片狀，細(xì)胞排列更加整齊，細(xì)胞均勻分布，生長(zhǎng)較均勻一致，雜細(xì)胞已較少(圖2)。傳6代以上的細(xì)胞可見(jiàn)胞體增大，胞質(zhì)稀薄，細(xì)胞的增殖速度較以前已有所減慢。傳至910代細(xì)胞已出現(xiàn)衰老死亡現(xiàn)象。2.3BSs鑒定流式細(xì)胞外表抗原標(biāo)志，D29表達(dá)為97.98，D106表達(dá)為63.38，D44表達(dá)為52.61，D34表達(dá)為0.66，D45表達(dá)為0.57(圖3a、b、)。2.4BSs生長(zhǎng)曲線，細(xì)胞周期及活力的檢測(cè)2.4.1生長(zhǎng)曲線P1、P3、P5BSs在接種的01d細(xì)胞

8、處于埋伏期，2d細(xì)胞開(kāi)場(chǎng)增殖，3d進(jìn)入快速生長(zhǎng)期，從5d開(kāi)場(chǎng)進(jìn)入平臺(tái)期(圖4)。2.5BSs與型膠原修飾的PLGA復(fù)合及增殖掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)BSs復(fù)合到型膠原修飾的PLGA支架后2d，即在PLGA基質(zhì)材料上黏附和伸展，呈成纖維樣細(xì)胞。7d時(shí)細(xì)胞數(shù)量已明顯增多，與支架材料結(jié)合較嚴(yán)密(圖7)。14d時(shí)，細(xì)胞增殖，互相間交融，并有大量的細(xì)胞外基質(zhì)分泌，大局部材料顆粒被覆蓋(圖8、9)。3討論BSs是一種存在于骨髓網(wǎng)狀間質(zhì)內(nèi)的非造血干細(xì)胞，具有分化成各種間葉組織的功能。近年來(lái)研究說(shuō)明BSs體外別離培養(yǎng)后，在一定的誘導(dǎo)條件下具有向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞等定向分化的才能7

9、，BSs為貼壁細(xì)胞，它外表標(biāo)志并非單一性，它表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和表皮細(xì)胞的外表標(biāo)志，BSs可以不斷自我復(fù)制而不分化，在其增殖分化過(guò)程中外表標(biāo)志不斷變化。一般認(rèn)為整合素家族成員D29,黏附分子D44,D106等是BSs保持未分化狀態(tài)時(shí)較為特異性的外表標(biāo)志8，雖然BSs與造血細(xì)胞共同存在于骨髓中，但不表達(dá)造血系統(tǒng)的標(biāo)志，如D14、D34及白細(xì)胞共同抗原D45。本實(shí)驗(yàn)從骨髓中別離貼壁生長(zhǎng)的BSs,流式細(xì)胞儀分析第4代BSs強(qiáng)表達(dá)D29，表達(dá)D44和D106，而不表達(dá)D34、D45，證實(shí)其為BSs應(yīng)用單核細(xì)胞別離液從骨髓中別離貼壁生長(zhǎng)的BSs是一種經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)單、有效的別離方法。本實(shí)驗(yàn)中別離所得的BS

10、s在低糖DE培養(yǎng)基中擴(kuò)增較迅速，具有較強(qiáng)的增殖才能，體外培養(yǎng)至第8代仍保持未分化狀態(tài)，為體外組織工程成骨提供了足夠的準(zhǔn)備時(shí)間。BSs作為骨組織工程中首選的種子細(xì)胞，具有取材方便，增殖才能、成骨才能強(qiáng)9，免疫原性弱10，11，基因容易導(dǎo)入等優(yōu)點(diǎn)，在目前骨組織工程中應(yīng)用非常普遍12。細(xì)胞與基質(zhì)材料的互相作用也是組織工程研究的主要領(lǐng)域，其中細(xì)胞與材料的黏附是根底，細(xì)胞必須與材料發(fā)生適當(dāng)?shù)酿じ?，才能進(jìn)展遷移、增殖和分化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明：BSs接種到支架材料上后24h就已貼附、伸展。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)：復(fù)合PLGA支架上的BSs在3d已結(jié)實(shí)地附著于材料外表，分泌胞外基質(zhì)，至復(fù)合后14d，BSs增殖明顯，細(xì)胞和分泌的胞外基質(zhì)已覆蓋材料大局部顆粒，提示BSs復(fù)合于PLGA后，其黏附、增殖和分化特性未受明顯影響。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)采用相別離法合成PLGA，經(jīng)型膠原修飾后其大體形態(tài)、微構(gòu)造等方面都令人滿意。BSs在體外復(fù)合PLGA后，通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)BSs可