1、急性甲醇中毒大鼠模型及其眼部改變的實驗研究佘潔婷，張少沖，程建新，冷云霞【摘要】【目的】討論急性甲醇中毒大鼠模型的制作方法及其眼部改變，為研究中毒后視功能損害及救治方法建立基矗【方法】SD大鼠32只，隨機分為A低劑量甲醇組、B高劑量甲醇組、生理鹽水對照組、D空氣對照組四組，每組8只。A、B組吸入N2/2混合氣及不同劑量甲醇灌胃，組吸入N2/2混合氣及生理鹽水灌胃，D組置于正常空氣中并按B組劑量給予甲醇灌胃，觀察各組大鼠一般情況、體質量及眼部改變、靜脈血甲醇濃度、視網膜電圖和視網膜組織學改變。【結果】染毒大鼠反響遲鈍、運動失調，視盤充血水腫、視網膜點狀出血，A組大鼠體質量為(18712)g，B組

2、為(17613)g，較、D對照組顯著減輕P0.05；A組視網膜電圖a、b波振幅分別為(8713)V、(18738)V，B組a、b波振幅分別為(5319)V、(13239)V，與對照組相比明顯下降P0.05；視網膜在光鏡下表現為各層細胞水腫、排列紊亂及空泡化；電鏡下細胞凋亡，線粒體腫脹、嵴斷裂；B組動物上述改變尤其明顯。【結論】吸入N2/2混合氣及甲醇灌胃可建立急性甲醇中毒的大鼠模型，出現典型的視網膜構造和功能改變。【關鍵詞】甲醇；急性中毒；大鼠模型；灌胃Abstrat:【bjetive】Tdevelparatdelanifestingauteethanlpisningandstudytheul

3、arhangessastlayfundatinsfrfurtherinvestigatinfvisualipairentausedbyethanlintxiatinanditstreatent.【ethds】Thirty-tSDratsererandlydividedintgrupA(lethanldsagegrup,n=8),B(highethanldsagegrup,n=8),(salinentrlgrup,n=8)andD(airntrlgrup,n=8).GrupAandBereexpsedtaixturefN2/2andgivendifferentdsagefethanlbygava

4、ge.GrupasexpsedtN2/2andgiventhesaevluefsalineasgrupB.GrupDasexpsedtnralairandgiventhesaedsagefethanlasgrupB.Generalnditin,bdyass,andularhanges,ethanlnentratininvenusbld,eletrretingraandretinalhistpathlgihangesereanalyzed.【Results】ethanl-intxiatedratsereharateristibyslreatin,inrdinatin,ptidishypereia

5、andedeaandretinalhaerrhage.BdyasslssassignifiantingrupAandBhenparedithgrupandD(P0.05),hihere(18712)ginAand(17613)ginB,respetively.A-aveandb-avefeletrretingraerearkedlyreduedingrupAandB(P0.05),hihas(8713)Vand(18738)VingrupA,and(5319)Vand(13239)VingrupB,respetively.Retinaledea,derangeentfellsandprinen

6、tvauleserebviusunderlightirspe.rphlgihangesundereletrirspeereharateristibyellapptsis,ithndriasllen,andristaedisruptin.ThesehangesererebviusingrupB.【nlusin】AuteethanlpisninginratsuldbesuessfullydupliatedbyexpsuretaixturefN2/2asellasethanladinistratinbygavage,ithtypialretinalstruturalandfuntinalhanges

7、.甲醇ethanl,H3H是一種無色、有毒的揮發性液體，可經呼吸道、胃腸道和皮膚吸收進入人體而中毒。近年因飲用假酒致急性甲醇中毒的事件時有發生，隨著甲醇在人們消費、生活中應用日益廣泛，其意外中毒的可能性不斷增加。中毒后幸存者常遺留不同程度的視覺損害，而目前甲醇致視功能損害的機理尚未明確，國內僅見臨床病例報道1，缺乏相關的實驗研究。國外研究采用的大鼠種屬在我國并不普及，在建模方法、染毒劑量、評價指標等方面缺乏系統性及可比性2,3。本研究采用SD大鼠，設立不同劑量甲醇灌胃組，借鑒人類急性甲醇中毒的診斷標準制訂該模型的評價指標，討論其眼部構造和功能改變，較系統地建立了急性甲醇中毒的大鼠模型，為今后進

8、一步研究視功能損害機理及救治方法打下基矗1材料和方法1.1主要試劑與儀器分析純甲醇廣州化學試劑廠，以生理鹽水稀釋成質量濃度為30的甲醇溶液；40L壓縮N22混合氣體11，廣州氣體廠；4多聚甲醛、蘇木素、伊紅中山眼科中心病理室提供；2.5戊二醛、1四氧化鋨中山大學醫學院電鏡室提供；枸櫞酸鈉抗凝管、生理鹽水；NEURPAK電生理檢查儀日本光電公司，Stei2000-顯微鏡德國ZEiSS，H-600透射電鏡日本HITAHI。1.2實驗動物分組及模型建立安康SPF級雄性SD大鼠32只廣東省醫學實驗動物中心提供，合格證號：粵監證字2022A010，體質量200220g，用隨機數排序分組法分為4組，每組8

9、只。A組：低劑量甲醇組；B組：高劑量甲醇組；組：生理鹽水對照組；D組：空氣對照組。從灌胃前4h起至實驗完畢，A、B、組大鼠均置于一密閉有機玻璃箱中，以2L/in的速度通入N22混合氣體，D組大鼠置于正常空氣中。開場通氣時間定為0h，分別在第4，24，48h給各組大鼠灌胃，A組：首次甲醇溶液灌胃劑量為2g/kg，其后每次1g/kg；B組：首次灌胃劑量4g/kg，其后每次2g/kg；組：與B組等體積的生理鹽水代替甲醇灌胃；D組：按B組劑量給予甲醇溶液灌胃。第60小時停頓通氣，作各項指標檢測。1.3模型的評價指標及方法1.3.1全身及眼部的中毒表現觀察甲醇灌胃后大鼠的反響、活動、意識狀態、體質量變化

10、；裂隙燈觀察結膜、角膜、前房、晶狀體改變；直接眼底鏡觀察視網膜血管、視盤等的改變。1.3.2視網膜電圖檢測于第60天取出大鼠暗適應4h，復方托品酰胺散瞳，氯胺酮50g/kg、氯丙嗪25g/kg混合腹腔注射，丁卡因表麻，Neurpak電生理儀檢測視網膜電圖Eletrretingra,ERG，記錄I16單次白光刺激下a波、b波埋伏期及振幅。所有操作均在有微弱紅光照明的暗室內進展，未檢查眼用不透光黑布遮蓋避光，角膜電極、參考電極和地電極分別置于角膜外表、舌下和尾部。1.3.3靜脈血甲醇濃度的檢測ERG檢查完畢后，剪開大鼠胸腔，從右心房抽取靜脈血2L注入枯燥真空的枸櫞酸鈉抗凝管中充分振蕩，采用頂空氣相

11、色譜法檢測血中甲醇濃度。1.3.4視網膜組織學檢查采血后以斷頸法處死大鼠，迅速摘除雙眼球，解剖顯微鏡下去除眼前節，別離視網膜，固定于4多聚甲醛中48h，按常規制成石蠟切片，HE染色，光鏡下觀察。1.3.5視網膜超微構造檢查按上述方法別離視網膜，剪出15大小視網膜組織，PBS漂洗，固定于2.5戊二醛4冰箱過夜，次日1四氧化鋨后固定2h，丙酮系列脫水，Epn812定向包埋制成超薄切片，醋酸雙氧鈾檸檬酸鉛雙染色，透射電鏡下觀察。1.4統計學分析實驗數據以均數標準差表示，采用SAS10.0統計軟件的ne-ayANVA及SNK-q檢驗對各組間差異進展分析，以0.05作為檢驗水準。2結果2.1中毒表現A組

12、大鼠毛色差，活動減少，消瘦；B組中1只大鼠于第2次灌胃后5h死亡，其余動物毛色灰暗，反響呆滯，明顯消瘦，運動失調，結膜及鼻孔出血。裂隙燈下各組動物角膜、前房、虹膜、晶狀體未見特殊改變；直接眼底鏡下A組動物出現視網膜血管輕度迂曲及點狀出血，B組動物視盤邊界不清，外表充血，視網膜灰白混濁，有點、片狀出血，血管迂曲變細。、D組動物毛色光滑，反響如常，眼底無異常改變。實驗完畢時，、D組體質量無顯著性差異；與對照組比擬，A、B組體質量下降，差異有統計學意義F=30.84，P0.0001，表1。2.2視網膜電圖A組、B組中分別有1只和2只大鼠ERG波形熄滅，其余數據見表2。A、B組大鼠的a涉及b波振幅較對

13、照組明顯下降P0.0001,B組b波埋伏期較其它組別延長P0.05，a波埋伏期無明顯改變P0.05。、D組ERG各成分之間差異無統計學意義P0.05。ERG波形改變見圖1。2.3靜脈血甲醇濃度標準曲線6.89890.008254AA為峰面積。相關系數r0.9938。A組靜脈血甲醇濃度為(43.816.5)l/L，B組為(219.041.0)l/L，均顯著高于組(3.42.4)l/L和D組(14.46.2)l/L(F=161.42,P0.0001)；其中B組比A組增高更為明顯P0.05。、D組甲醇濃度處于較低程度，兩組之間差異無統計學意義P0.05。2.4視網膜病理改變2.4.1光鏡改變A組視網

14、膜內、外顆粒層排列紊亂，細胞間隙擴大，神經節細胞層輕度水腫圖2A；B組視網膜各層水腫，光感受器外節出現空泡，外顆粒層、內顆粒層排列明顯紊亂，細胞間隙擴大，神經節細胞層疏松、水腫，空泡明顯圖2B；組、D組視網膜形態正常，構造清楚，各層細胞排列整齊、嚴密圖2、D。2.4.2電鏡改變B組內、外顆粒層細胞凋亡普遍，細胞核固縮，細胞器構造不清圖3A；光感受器膜盤排列紊亂、腫脹并出現空泡圖3B；內、外節及內、外叢狀層線粒體廣泛腫脹，部分線粒體嵴斷裂、空泡化甚至嵴消失圖3。A組改變較B組輕，有細胞凋亡現象但不常見。、D組大鼠視網膜超微構造正常，細胞排列嚴密，染色質疏松、明晰，膜盤排列整齊，線粒體形態正常圖3

15、D、E、F。3討論3.1急性甲醇中毒的臨床診斷標準及模型評價指標人類急性甲醇中毒主要表現為神經系統和眼部的損害，臨床診斷標準根據甲醇攝入史、血液甲醇濃度超標、神經系統及眼部損害的病癥和體征如頭痛、意識障礙、視物模糊、視野損害、視網膜電圖和視覺誘發電位異常等1,4。本研究采用灌胃的方式模擬甲醇經口染毒的過程，并借鑒了人類急性甲醇中毒的診斷標準制訂出該模型的評價指標，包括中毒后的一般表現、靜脈血甲醇濃度、ERG及視網膜病理改變，從功能學和形態學兩方面評價甲醇中毒對眼部的影響，結果顯示大鼠中毒后上述各項指標與人類中毒后的改變非常接近，說明吸入N2/2混合氣及甲醇灌胃可復制出典型的急性甲醇中毒大鼠模型

16、。3.2模型建立的關鍵點嚙齒類動物由于體內四氫葉酸程度比靈長類高，能輔助10-甲酰四氫葉酸脫氫酶10-FDH降解甲醇毒性代謝產物，不容易產生甲醇中毒5,6。N2:2混合氣能抑制大鼠體內四氫葉酸鹽合成7，使10-FDH缺乏輔助因子而喪失解毒才能，是本模型制作的關鍵之一。通入N22混合氣4h后開場灌胃是為了完全抑制10-FDH的活性，再采用首次劑量加倍、重復兩次灌胃的方法，使大鼠體內的甲醇濃度到達一個相對恒定的狀態，保證了建模成功。生理鹽水對照組組未出現任何異常表現，說明N2:2混合氣對大鼠的正常生理狀態無影響。為評價不同劑量甲醇對大鼠的影響，本實驗將動物分為低、高劑量甲醇灌胃組比擬，發現高劑量組

17、B組中毒表現更為突出，且有動物死亡；低劑量組A組各種改變較輕，這種建模方法能較全面地模擬人類不同程度的中毒表現。3.3急性甲醇中毒的眼部損害及其可能機制甲醇對眼部損害主要表達在眼底的異常改變。ERG是反映視網膜功能的一項無創、敏感檢查，a波代表了視網膜光感受器的電位變化，b波起源于ller細胞和雙極細胞，反映視網膜內顆粒層區域細胞的電活動8。本實驗結果顯示甲醇對光感受器和內顆粒層細胞均有毒性作用，對視網膜視覺信號傳導產生了嚴重影響。視網膜形態學改變表現為視網膜各層組織的水腫、細胞排列紊亂；細胞器的改變以線粒體最為突出，表現為腫脹、嵴斷裂甚至消失；細胞凋亡也不少見，上述病理改變在高劑量組尤其顯著

18、。有研究9,10認為甲醇的毒性代謝產物甲酸可抑制線粒體細胞色素氧化酶的功能，使ATP合成受阻，并消耗大量復原型谷胱甘肽，增加細胞氧化應激，本實驗中毒大鼠視網膜的病理改變與此觀點相符。視網膜各層尤其是光感受器細胞的生化代謝極為活潑，是全身耗氧量較高的器官之一。線粒體電子傳遞及氧化磷酸化受阻，不能為視網膜提供足夠的能量供給，必然導致細胞離子泵功能障礙，各層組織以及細胞器的明顯水腫。ATP除了是細胞賴以生存的能量分子之外，還可能通過嘌呤受體P2X7介導細胞的凋亡11。此外，中毒動物視網膜水腫、血管迂曲變細的眼底改變還可能與部分血管活性物質異常變化有關，眼底血液循環障礙加重了組織缺血缺氧狀態，細胞能量

19、耗竭及由此觸發的細胞凋亡可能是急性甲醇中毒致視功能損害的重要機制，有待今后進一步深化研究。【參考文獻】江朝強，吳一行，劉薇薇，等.急性甲醇中毒的臨床救治J.中華勞動衛生職業病雜志，2022，233：206-209.EELLSJT.ethanl-induedvisualtxiityintheratJ.JPharalExpTher,1991,257(1):56-63.GARNERD,LEEE,TERZTS,etal.Rlefretinaletablisinethanl-induedretinaltxiityJ.JTxilEnvirnHealth,1995,44(1):43-56.程建新，張少沖，江朝強，等.急性甲醇中毒診斷分級中自動視野和P-VEP表現J.中國實用眼科雜志，2022，246：585-588.ARTINASEVIK,GREEND,BARNJ,etal.Fl