1、實驗純化雞蛋清溶菌酶的熱穩定性分析一、實驗目的了解各環境因素（如：溫度、pH值等）對酶穩定性的影響。了解衡量酶穩定性的指標：半衰期T1/2。二、實驗原理酶的穩定性常用半衰期（T1/2:一定條件下酶活力喪失50%所需的時間）來衡量。一般來說半衰 期越長表明酶在特定條件下的穩定性越好。溶菌酶的熱失活行為可簡化為不可逆的一級失活模型令時間為t時活性酶的濃度為E,酶活性為A，則有:d EV = k E E dt d tE = E Dexp( 一 k t) ln E = ln E 一 k t ln A = In A - k tIn -b = k tAd t(2) ln 2T1/ 2A ,根據式（1），以

2、lnT對處理時間t作圖其斜率即為kd。進而通過式（2）便可求得半衰期（T1/2）。 t實驗材料、試劑、儀器材 料：實驗二親和層析所得的純化雞蛋清溶菌酶。試劑：0.5 mol/L NaOH。儀器；pH計、離心管、金屬浴四、實驗步驟酸性條件下溶菌酶的穩定性稀釋5倍75 C純化溶菌酶分裝離心管（0.5mL/管）分別處理0,10, 20, 40, 60 min保溫冷卻至室溫測酶活堿性條件下溶菌酶的穩定性稀釋5倍75 C純化溶菌酶調pH值調至8.0左右一-分裝離心管（0.5mL/管）分別保溫冷卻至室溫處理 0, 10, 20, 40, 60 min測酶活酶活的測定及計算方法方法：玻璃比色杯快速混勻底物懸

3、浮液2.0mL加入0.05mL酶液f測人心風皿值1min內的變化（】5s記錄一次）計算：采用自定義酶活性單位（U）：當前測定條件下，測定體系在450 nm波長下吸光度每分鐘下降0.01所需的酶量為1個酶活力單位（U）。酶活力a （U/mD = AA450nm/（L0 min x頃x酶液體積）。五、實驗結果與分析：觀察加熱處理中酶液的變化情況（如沉淀的出現）。加熱處理中，本組的酶液用肉眼觀察，變化不太明顯，渾濁度微微大了一些。以“相對活力”對“加熱處理時間”作圖。表1酸性條件下溶菌酶酶活力處理組010min20min40min60min0s0.6810.6320.5870.5370.55115s

4、0.5980.5870.5160.4680.49930s0.5430.5260.4620.4190.45845s0.4920.4540.4150.3770.4260s0.4490.3950.3750.340.381A450nm0.2320.2370.2120.1970.17酶活力（U/mL）464474424394340相對活力（）100102.1551791.3793184.91473.27586表2堿性條件下溶菌酶酶活力處理組010min20min40min60min0s0.5870.5680.5890.6420.68615s0.4870.480.5050.5620.63930s0.409

5、0.4250.4510.5110.59945s0.3240.3830.4080.4760.56260s0.2580.3440.3680.4440.531fnm0.3290.2240.2210.1980.155酶活力（U/mL）658448442396310相對活力（）10068.0851167.1732560.1823747.11246不同pH條件處理不同時間的相對酶活變化酸性條件相對酶活一堿性條件相對酶活204060處理時間（min）80圖1酸堿條件處理不同時間的相對酶活變化以ln。0對處理時間t作圖，其斜率即為k，進而便可求得半衰期（T化）。， Ad1/2t圖2酸堿條件處理后的斜率圖由圖2

6、可看出，兩條方程的擬合效果不太理想，相對系數均小于0.95。且酸性條件的斜率k1=0.0055， 堿性條件的斜率k2=0.0104，k1 T”（堿），說明溶菌酶在經過堿處理后， 酶活喪失得更快，這與事實是相符的。比較兩者酶液熱穩定性的差異，并分析環境pH值條件對酶分子熱穩定性影響的原因。根據表1、2所得數據，做出圖1。由圖1可以看出：（1）雞蛋清溶菌酶較穩定。即使在75C下處理 60min，酸性下仍有73.28%的相對酶活，堿性下也還有47.1%。（2）從兩條曲線的趨勢可以看出，溶菌酶 在酸性條件下更加穩定，處理2060min時的相對酶活均較高；堿性條件下，溶菌酶的相對酶活隨著時間 的增加而逐漸下降。pH值條件對酶分子熱穩定性影響的原因：在溫度不變的前提下，（1） pH過小（過酸）或過大（過 堿）都能使酶蛋白變性而失活，使其熱穩定性下降。（2）pH的改變能影響酶活性中心基團的解離程度， 同時也可以影響底物和輔酶的解離程度，從而影響酶分子對底物分子的結合和催化。但應該注意，酶的最 適pH不是一個常數，它的大小與底物的種類和濃度、緩沖液的性質和濃度、介質的離子濃度