1、RNAi技術應用的研究進展生命學院2010級生命基地班喻曙光。RNAi( RNA interference)，即RNA干擾是由與靶基因同源的內源或外源雙鏈RNA( double stranded RNA, dsRNA )所引發的一種在動植物中普遍存在的基因沉默現象。它最早在植物體中被發現，現在已發展成為一 種生物技術，并成為了后基因時代的重要研究手段。對RNAi技術在生物基礎、醫學、藥學和植物學等領 域的研究成果進行綜述。RNAi的發現1989年，Matzke等門首次報道了啟動子介導的序列同源性基因共轉染煙草，可引起轉基 因表達發生沉默的現象。1990年，Napoli等把已知色素基因置于強啟動

2、子后，導入矮 腳牽牛花中，試圖加深牽牛花的顏色，結果卻發現花的顏色全部或部分變白。該現象在當時 被稱為“共抑制”(co-suppression)，即導入基因后，該基因和牽牛花內源的著色基因都 被抑制了。1995年，康奈爾大學的Guo等嘗試用反義RNA去阻斷線蟲的par-1基因表 達，結果發現反義RNA的確能阻斷目的基因的表達，但作為對照的正義RNA，雖不能與活 性RNA結合，也照樣能引發抑制。1998年，Fire4將雙鏈RNA( dsRNA)正義鏈與反義鏈的混合物注入線蟲后，結果出現了比單獨注入單鏈要強得多的沉默，并且導致子一代 同源基因的沉默。這種現象被稱為“RNA干擾”(即RNAi，RNA

3、 interference) o同時， 這也是人們第一次對RNAi技術的應用。隨后的研究發現，RNAi現象在多種生物中存在， 如線蟲、果蠅、斑馬魚、真菌以及植物等，生物體可利用RNAi來抵御病毒的感染，阻 斷轉座子的作用5。RNAi 的定義目前對RNAi的定義有很多種，不同的資料對其定義的側重點也不盡相同，如果將RNAi看 作一種生物學現象，可以有以下定義:(1) RNAi是由雙鏈RNA介導的、由特定酶參與的特 異性基因沉默現象，它在轉錄水平、轉錄后水平和翻譯水平上阻斷基因的表達(2) RNAi是 有dsRNA參與指導的，以外源和內源mRNA為降解目標的轉基因沉默現象，具有核苷酸 序列特異性的

4、自我防御機制，是一種當外源基因導入或病毒入侵后，細胞中與轉基因或入侵 病毒RNA同源的基因發生共同基因沉默的現象。RNAi這種現象已被證實在植物中廣泛存 在，它可能是生物的發育調控及抗外源或內源侵染的一種普遍機制。2002年，該發現被 Science雜志評為十大科技突破之一。如果將其作為一門生物技術，則可以定義為:(1) RNAi 是指通過反義RNA與正鏈RNA形成雙鏈RNA特異性地抑制靶基因的現象，它通過人為地 引入與內源靶基因具有相同序列的雙鏈RNA(正義RNA和反義RNA)，從而誘導內源靶基 因的mRNA降解，達到阻止基因表達的目的;(2) RNAi是指體外人工合成的或體內的dsRNA

5、在細胞內特異性的將與之同源的mRNA降解成21 - 23 nt的小片段，使相應的基因沉默 的技術;(3) RNAi是將與靶基因的mRNA同源互補的dsRNA導入細胞，特異性地降解該 mRNA，從而產生相應的功能表型缺失的技術，屬于轉錄后水平的基因沉默(post-transcriptional genesilence， PTGS)。各種不同定義雖然說法不同，但所描述的事 實是大體相同的，即RNAi就是指由dsRNA介導的基因沉默現象。RNAi 的分子機制目前研究認為，RNAi的過程可能包括起始和效應兩個階段。在起始階段，加入的小分子RNA 被切割為21 23 nt 長的小分子干擾RNA 片段(s

6、mall interfering， RNAs， siRNAs)，其中一個稱為Dicer的酶，是RNaseH家族中特異識別雙鏈RNA的一員，它能以一種ATP依賴的方式逐步切割由外源導入或者由轉基因、病毒感染等各種方式引入的雙 鏈RNA，將RNA降解為19 - 21 bp的雙鏈RNAs( siRNAs)，每個片段的3端都有2個堿 基突出。在RNAi效應階段，siRNA雙鏈結合一個核酶復合物從而形成所謂RNA誘導沉 默復合物(RNA-induced silencing complex， RISC) 。激活RISC 需要一個ATP 將小分 子RNA解雙鏈的過程，激活的RISC通過堿基配對定位到同源mR

7、NA轉錄本上，并在距離 siRNA 3端12個堿基的位置切UmRNA6j。盡管切割的確切機制尚不明了，但每個RISC都 包含一個siRNA和一個不同于Dicer的RNA酶。另外，還有研究表明，含有啟動子區的 dsRNA在植物體內同樣被切割成21 -23 nt長的片段，這種dsRNA可使內源相應的DNA 序列甲基化，從而使啟動子失去功能，使其下游基因沉默。4 RNAi技術的應用現狀近年來，作為一種高效、特異性強的基因阻斷技術，RNAi技術發展迅速，在生物學基礎、 醫學、藥學和植物學等很多領域的研究均得到較大發展。4. 1 RNAi在基礎學方面的研究4. 1. 1真核細胞基因功能的研究隨著基因測序

8、技術和生物信息學的不斷發展，果蠅、線蟲、 水稻、小鼠和人類基因組測序已經完成，而基因功能的研究步伐卻相對緩慢。與傳統的基因 功能研究方法(如基因敲除、反義RNA技術等)相比，RNAi技術是一種高效、特異、快捷 和成本相對低廉的基因功能研究手段。利用RNAi技術，可以在RNA水平部分阻斷某基因 的表達，獲得功能性喪失，進一步研究相關基因的功能。Dunn等刃利用RNAi技術針對 海葵肌動蛋白和半胱氨酸蛋白酶這兩個基因，用原位雜交的方法證實這兩個基因的表達均受 到抑制，進而研究該基因的功能。4. 1. 2信號轉導通路的研究利用RNAi技術可以容易地確定復雜的信號轉導途徑中相關基 因的上下游關系及其作

9、用。James等應用RNAi技術研究了果蠅細胞系中胰島素的信號 傳導途徑，取得了與已知胰島素信號通路完全一致的結果。另外，基因組范圍的RNAi表型 篩選已成為研究基因在特殊細胞功能和生物活性中作用的一種有效方法，但對于相關基因之 間的相互關系還是不能確定。4. 1. 3其他基礎研究除了以上兩個主要應用方面外，RNAi技術還被應用于生理學、生長發 育過程等方面的基礎研究中。Palmer等利用RNAi技術進行動物細胞離子通道生理學的 研究和應用。4. 2 RNAi在醫學方面的研究4. 2. 1利用RNAi建立疾病模型傳統的建立人類疾病動物模型是利用基因敲除和Cre-LoxP systems方法，但

10、是如果目的基因是小鼠發育必需基因的話，這些方法就會受到很大的限制。 RNAi技術將是建立轉基因動物模型的新的工具，隨著該技術的發展，它可以通過使組織特 異的基因功能滅活，不再需要條件定向小鼠和組織特異重組小鼠，因而轉基因動物將是使用 更加廣泛的生物研究工具10。遺傳基因工程小鼠已被廣泛用于建立人類癌癥模型，模型小鼠模擬人類癌癥相應的形態學，組織病理學、表型和基因型。這樣的疾病模型 對于分析特殊癌癥基因和修飾基因的作用、評價常規癌癥治療和新藥、鑒定癌癥腫瘤生長標 記、分析腫瘤微環境對腫瘤形成的影響、定義潛伏期和腫瘤發展分期等都優于傳統的轉基因的疾病模型。目前，乳腺、胰腺、腸、結腸和前列腺癌癥的基

11、因工程小鼠 模型已經構建，而腦、卵巢、頸和皮膚癌癥模型正處于研究的初期階段11O RNAi除了被 用于建立癌癥疾病模型外，也用于其他疾病模型的建立和保護方面。Shcherbata等12利用 遺傳和RNAi誘導果蠅細胞激化和肌營養不良表型Kim等13構建重組體慢病毒將shRNAs 定向轉移到保守的柯薩奇腸道病毒序列中，用于防治病毒性心肌炎，提高病毒性心肌炎動物 模型的成活率。但是利用RNAi建立的疾病動物模型的性狀持續時間不太長，而且不一定能 被穩定遺傳，還有其他問題有待繼續研究。4. 2. 2 RNAi抗病毒治療目前，RNAi在抗病毒中的研究主要是設計相應的siRNA,誘發特異的mRNA降解，

12、從而發 揮有效的抗病毒作用。美國麻省理工大學(MIT)的Novina最早開展了利用RNAi抗HIV的 研究，開啟了利用RNAi治療病毒性疾病的先河。隨后，又有學者參與到這個研究中來，他 們針對HIV生活周期的不同階段設計了多種siRNA，針對HIV病毒gag、tat、rev和nef等 基因的siRNA可用以控制病毒復制。研究證實針對病毒基因組的gag區域的siRNA可以有 效的將病毒的基因“沉默”，抑制HIV病毒的復制能力13 15 16】。此外，還有人開展了RNAi 針對其他病毒，如呼吸道合胞病毒、SARS病毒、脊髓灰質炎病毒等的作用的研究，如用脊 髓灰質炎病毒基因組的siRNA處理人類和鼠

13、的細胞，可明顯減少子代病毒的數量，并能促 進病毒從感染細胞中清除的速度17。4. 2. 3 RNAi在腫瘤治療中的研究1、RNAi技術具有高效沉默特定靶基因的特點，在確定單個基因在腫瘤發生發展中的作用 以及探索腫瘤的基因治療方面是一種強有力的研究工具，因此其應用十分廣泛。原癌基因的 活化和/或抑癌基因的失活會導致腫瘤的發生，基于RNAi技術在單基因研究中的優勢，利 用RNAi抑制腫瘤細胞內的癌基因和抑癌基因的功能表達，分析其表型變化，有利于揭示腫 瘤發生發展的分子機制，從而為腫瘤的診斷和治療提供標記物和治療靶點。Wang等函用 RNAi干擾HeLa細胞中CML66的表達后發現HeLa細胞的增殖

14、、侵襲和轉移能力受抑，進 一步研究其機制發現CML66表達受抑后cathepsin L、MMP15、uPAR、VEGF、COX-2、S100A4、MUC1、MDM2 和RAC1均下調，從而推斷出CMI 66作為致癌基因通過多途徑促進腫瘤的增殖、侵襲和轉移。應用RNAi技術對腫瘤侵襲與轉移的發生機制及有關基因的 改變進行研究，有助于加深理解惡性腫瘤的生物學本質。Shin等19通過RNAi技術敲除 eaveolin-1表達，從而調節血管細胞黏附分子1( VCAM-1)的表達，使得依賴于VCAM-1的 腫瘤細胞的黏附顯著受抑;Tsuchiya等20通過RNAi制備Id1、Id3( Inhibitor

15、 of DNA binding proteins，Id)雙倍敲除的胃癌細胞系MKN45,證實Id1、Id3的敲除顯著抑制胃癌細胞腹膜 轉移。Jiang等知通過RNAi抑制MDA-MB-231和MCF-7 中MTA1基因的表達，從而下 調ERa的表達，結果使這兩株乳腺癌細胞的侵襲活性下降。另外，Wang等22設計了針 對目前所知的最強的凋亡抑制因子生存素(survivin )表達的RNAi，導入人食管鱗狀上皮細胞癌細胞系KYSE510中，證實下調survivin可以強烈抑制體內和體外癌細胞生長，推 測這種抑制可能是通過誘導凋亡的增強。該研究可加深對食管癌發生機制的了解，而且說明 survivin

16、可能是治療食管癌潛在的靶位點，RNAi具有潛在的治療價值。目前國內利用RNAi 抑制survivin的表達在胰腺癌、宮頸癌、肺癌、大腸癌、神經母細胞癌、骨肉瘤細胞和白血 病細胞中均有研究，不過大部分還停留在體外研究階段。4. 3 RNAi在藥學方面的研究利用RNAi進行藥物研究利用RNAi能夠特異高效地抑制基因表達，獲得去基因功能表型， 能夠在短時間內大規模篩選靶點，從而實現了在細胞水平和動物水平篩選藥靶和評定藥靶 *。Hamamichi24利用RNA干擾，系統屏蔽帕金森病模型中將近900個候選基因和通路， 找到了兩個帕金森病遺傳易感性位點和治療靶點，從而為該疾病的治療奠定基礎。RNAi在 被

17、廣泛應用于功能基因組研究確定了大量潛在的藥物作用靶點的同時，也被證實其作為 新一代基因治療藥物的可能性。2006年，美國Acuity制藥公司生產的用于治療濕性老年黃 斑病變的RNAi藥物Bevasiranib在RNAi臨床試驗方面取得成功，它在療效、安全性方面都優于常規藥物。除Acuity制藥公司外，另有兩家公司也在進行RNAi藥物的開發， 一是Alnylam Pharmaceuticals，他們開發的RNAi藥物用來治療呼吸道合胞病毒、流行性 感冒、帕金森病和高膽固醇血癥等二是Sirna Therapeutics，他們開發治療ADM的RNAi 藥物Sirna-027已經進入1期臨床。其他方面

18、的應用如治療Huntington病和哮喘以及COPD 也進入臨床前研究階段。但是RNAi藥物仍存在如給藥途徑、使用安全性等方面的問題。4. 4 RNAi在植物學方面的研究RNAi現象首先是在植物研究中發現的，因此RNAi技術在植物方面的應用研究也比較深 入，包括植物功能基因組的研究、植物生長發育的研究、植物抗病性方面的研究和植物改良 方面的研究等多個領域25】。4. 4. 1植物功能基因組的研究隨著后基因組時代的到來，人們越來越需要大規模、高通量地 研究基因的功能。由于RNAi具有高度的序列專一性和有效的干擾活力，可以特異地使某些 基因沉默，從而獲得功能喪失或降低突變。因此，它可以作為研究基因

19、組學的一種有效工具。 在2002 年11 月，歐洲第五計劃（the Arabidopsisgenomic RNAi knock-out line analysis， AGRIKOLA）就已準備用RNAi技術來研究擬南芥所有基因（約25 000個）的功能，方法是利 用擬南芥所有基因片段構建組成型和誘導型RNAi載體，通過農桿菌介導轉化擬南芥獲得4 000多個組成型hpRNA植株26。另外，Travella等在構建的PDS-RNAi和EINIRNAi 的六倍體小麥轉基因作物中，成功地抑制了目的基因。Lawrence等也曾用擬南芥著絲 點甲基化相關的dsRNA，對擬南芥的四倍體進行RNA干擾，發現擬

20、南芥的四倍體中對應的 與甲基化有關的mRNA含量水平劇減。這些都可以證明RNAi技術是多倍體植物功能缺失 突變很好的工具。4. 4. 2植物生長發育及新品種培育的研究雄性不育是高等植物生命活動的一個常見現象，在農業上有巨大的應用價值。Cigan等皿】利用 RNAi技術直接沉默玉米的花粉囊基因表達的啟動子MS45,從而抑制花粉囊的形成，形成 玉米的雄性不育株。利用RNAi技術可以創造一些優良的不育材料。Moritoh等或觀察 OSGEN-L-RNA的水稻植株，發現一部分育性很低，一部分水稻雄性不育，找到了水稻的 雄性不育材料。經濟作物的作用成分含量增加或降低，可以提高作物的經濟價值和利用效率。

21、張銀波等甲利用RT-PCT技術克隆了油菜PEP基因片段并構建了對應于PEPASE基因 的RNAi載體，以利用RNAi技術抑制PEPASE基因的表達，使代謝流偏向油脂合成，從 而提高油菜籽粒中的油脂含量。另外，還有采用果實特異啟動子結合RNAi技術抑制番茄內 源光形態，建成調節基因DET的表達，結果使再生植株中DET1的表達下降，類胡蘿卜和 類黃酮含量明顯升高，而果實的其他品質參數沒有發生大的改變。這些均表明利用器官特異 基因的沉默可以改善植物營養價值。另外，Shinjiro等勿利用RNAi技術對控制咖啡因合 成的基因進行抑制，使材料中的咖啡因含量降低了50% - 70%。RNAi技術可針對植物的 一些表型進行改良，這為人們生活增添了許多樂趣，也增加了一些植物更多經濟價值；從另 一層次來說，該技術豐富了植物的品種，尤其是對花卉品質的改良。日本生物研究所使用 RNAi