1、基因組編輯技術基因組編輯技術基因組編輯技術的介紹基因組編輯技術的介紹p 基因組編輯技術是一種可以在基因組水平上對DNA序列進行改造的遺傳操作技術。p 這種技術的原理是構建一個人工內切酶，在預定的基因組位置切斷DNA，切斷的DNA在被細胞內的DNA修復系統修復過程中會產生突變，從而達到定點改造基因組的目的。p 通過修復途徑，基因組編輯技術可以實現三種基因組改造，即基因敲除，特異突變的引入和定點轉基因p 基因組編輯是研究基因功能的重要手基因組編輯是研究基因功能的重要手段之一，也可被用于人類遺傳性疾病段之一，也可被用于人類遺傳性疾病的治療，因此這類技術成為現代分子的治療，因此這類技術成為現代分子生物

2、學的研究熱點生物學的研究熱點基因組編輯三大利器介紹 ZFN:Zinc-finger nucleases 鋅指核糖核酸鋅指核糖核酸酶酶 TALENs:transcription activator-like effector nucleases 轉錄激活因子樣效應轉錄激活因子樣效應物核酸酶物核酸酶 CRISPR/ Cas9 :clustered regularly interspaced short palindromic repeats 成簇的規律間隔的短回文重復序列成簇的規律間隔的短回文重復序列/ CRISPR-associated 9 Zinc Finger Nuclease(ZFN)-

3、是一種常出現在DNA結合蛋白質中的一種結構基 元。鋅螯合在氨基酸鏈中形成鋅的指狀結構。- 對基因調控起重要的作用。根據其保守結構域的不 同，可將鋅指蛋白主要分為C2H2型、C4型和C6型。 鋅指通過與靶分子DNA、RNA、DNARNA的序 列特異性結合，以及與自身或其他鋅指蛋白的結合 在轉錄和翻譯水平上調控基因的表達、細胞分化以 及胚胎發育。- 結構 24-30 個氨基酸殘基 形成-二級結構 兩保守的半胱氨酸和組氨酸配位一個鋅原子。What is a Zinc Finger?Zinc finger nuclease (ZFN) 由一個 DNA 結合域（DNA-binding domain）和一

4、個非特異性核酸內切酶Fok1構成。DNA 結合域是由一系列 Cys2-His2鋅指蛋白（zinc-fingers）串聯組成（一般 34 個），每個鋅指蛋白識別并結合一個特異的三聯體堿基。Genetics, Vol. 188, 773782ZFN mediated genome editing FOK1二聚體互作 與非同源性末端接合(Non-homologous end joining, NHEJ)和同源重組（Homologous Recombination)等方法結合使用 同源二聚體或單一ZFN單元的結合造成非特異性酶切，即脫靶效應（off-target）ZFN mediated genome

5、 editing ZFN的限制性的限制性已建有已建有ZFN庫，識別多種庫，識別多種DNA序列，但不序列，但不能達到識別任意靶能達到識別任意靶DNA，其應用受到限制。，其應用受到限制。細胞毒性細胞毒性大量脫靶位點的出現導致基因大量脫靶位點的出現導致基因組的破壞組的破壞構建繁瑣構建繁瑣識別特性決定構建難度大，時識別特性決定構建難度大，時間長間長Transcription activator like effector nuclease(TALEN)Plant Bacterial TAL Effector n發現：1989年，植物病原體黃擔保菌屬（Xanthomonas spp.）avrbs3基因n

6、發展：2007年，發現其序列特異性核酸結合特性，avvrBs3-TA. 2009年，TAL effector 氨基酸序列與核酸靶序列的密碼被破譯、n應用：2011年，Nature Biotechonlogy同時發辮四篇TALEN基因敲除文章和一篇綜述Functional domains of Xanthomonas TAL effectorsp N-端包括一個移位子信號端包括一個移位子信號p C-端包括一個核定位信號和轉錄激活域端包括一個核定位信號和轉錄激活域p 中間的重復序列決定其特異性中間的重復序列決定其特異性 The number of repeats in TAL effectors

7、varies between 1.5 and 33.5 The general repeat length is 34 aaTAL 效應蛋白的不同結構功能域Code of DNA Binding Specificity of TAL-Type III Effectorsl一系列（12或以上）串聯重復序列構成識別元件l每個重復有34個氨基酸殘基l除12和13位其余都高度保守l重復序列可變的雙氨基酸殘基(repeat-variable diresidues, RVD) NI-A, HD-C, NN-G/A, and NG-TlOrigin： bacterium Flavobacterium oke

8、anokoites海床黃桿菌海床黃桿菌l由一個N-端DNA識別域和C端剪切域組成lFokI 二聚化才有剪切活性Structure of the FokI dimerFok ITale nucleases (TALENs): hybrid proteins composed of TAL effectors and FokI DNA-cleavage domain16The principle of TALEN-mediated gene targeting(基本原則基本原則).利用TALEN在特定位點創造DSB.利用細胞HR（同源重組）修復機制實現基因修飾.利用細胞NHEJ（非同源性末端接合）

9、修復機制實現基因修飾TALENs的優缺點 TALEN 技術是一種嶄新的分子生物學工具。利用TAL的序列模塊，可組裝成特異結合任意DNA序列的模塊化蛋白，從而達到靶向操作內源性基因的目的，它克服了ZFN方法不能識別任意目標基因序列，以及識別序列經常受上下游序列影響等問題，而具有ZFN相等或更好的靈活性，使基因操作變得更加簡單方便。 然而，構建過程中，TALE 分子的模塊組裝和篩選過程比較繁雜，需要大量的測序工作。對于普通實驗室的可操作性較低。 CRISPR/Cas9 system CRISPR-Cas系統簡介系統簡介 CRISPR-Cas系統的研究歷史系統的研究歷史p 1987 年，日本課題組在

10、年，日本課題組在K12 大腸桿菌的堿性磷酸酶基因附近發現串聯間大腸桿菌的堿性磷酸酶基因附近發現串聯間隔重復序列，隨后發現其廣泛存在于細菌和古細菌的基因組中，隔重復序列，隨后發現其廣泛存在于細菌和古細菌的基因組中，2002 年，年，正式將其命名為正式將其命名為成簇的規律間隔的短回文成簇的規律間隔的短回文重復序列重復序列p 2005 年發現年發現CRISPR 的間隔序列的間隔序列(spacer)與宿主菌的染色體外的遺傳物質與宿主菌的染色體外的遺傳物質高度同源，推測細菌可能通過高度同源，推測細菌可能通過CRISPR 系統可能以類似于真核生物的系統可能以類似于真核生物的RNAi 方式抵抗外源遺傳物質的

11、入侵。方式抵抗外源遺傳物質的入侵。p 2007 年，年，Barrangou 等首次發現細菌可能利用等首次發現細菌可能利用CRSPR 系統抵抗噬菌體入系統抵抗噬菌體入侵；侵；2008 年，年，Marraffini 等發現細菌等發現細菌CRISPR 系統能阻止外源質粒的轉系統能阻止外源質粒的轉移，首次利用實驗驗證了移，首次利用實驗驗證了CRISPR 系統的功能系統的功能p 2013 年初，年初，MIT 的研究組首次利用的研究組首次利用CRISPR/Cas9 系統對人系統對人293T 細胞細胞EMX1 和和PVALB 基因以及小鼠基因以及小鼠Nero2A 細胞細胞Th 基因實現了定點突變。同基因實現

12、了定點突變。同年年Mali 利用利用CRISPR/ Cas9 在人在人293T 細胞和細胞和K652 細胞基因的靶位點形成細胞基因的靶位點形成雙鏈或單鏈的切口，從而激活細胞的雙鏈或單鏈的切口，從而激活細胞的DNA 修復機制高效介導外源基因定修復機制高效介導外源基因定點插入。點插入。 CRISPR-Cas系統的結構系統的結構p CRISPR-CAS 系統的組成主要包括: 由不連續的重復序列R( repeat) 與長度相似的間區序列S( spacers) 間隔排列而成的CRISPR 簇，前導序列L( leader) 以及一系列CRISPR 相關蛋白基因cas。 CasCas蛋白是一種雙鏈蛋白是一種

13、雙鏈DNADNA核酸酶，能在核酸酶，能在guide RNAguide RNA引導下對靶位點進行切割。它引導下對靶位點進行切割。它與與folkfolk酶功能類似，但是它并不需要形酶功能類似，但是它并不需要形成二聚體才能發揮作用。成二聚體才能發揮作用。 CRISPR-CAS CRISPR-CAS 系統的作用機理系統的作用機理 CRISPR-CAS CRISPR-CAS 系統的作用機理系統的作用機理p CRIPSR 基因座的表達(包括轉錄和轉錄后的成熟加工) 當該噬菌體再次入侵細菌時，CRISPR 簇首先轉錄為長的crRNA前體，然后逐步被加工成小的成熟的crRNA。pCRISPR/Cas 系統活性

14、的發揮或者是對外源遺傳物質的干擾 crRNA 結合相關的Cas 蛋白后，形成crRNA-Cas 蛋白復合體，通過堿基互補配對精確地與目標DNA相結合，隨后Cas 蛋白對目標DNA 進行斷裂和降解。 Guide RNA: crRNA（ CRISPR-derived RNA ）通過堿基配對與 tracrRNA （trans-activating crRNA ）結合形成 tracrRNA/crRNA 復合物。通過人工設計這兩種 RNA，可以改造形成具有引導作用的sgRNA （short guide RNA ） Cas9: 復合物引導核酸酶 Cas9 蛋白在與 crRNA 配對的序列靶位點剪切雙鏈 D

15、NA。HNH結構域剪切配對的部分， Ruvc結構域剪切未配對的鏈。HNHRuvCN代表任意DNA堿基Mechanism of CRISPR/Cas9 to target DNA蛋白質：核酸聚合物蛋白質：核酸聚合物CRISPR/Cas在基因改造中的應用在基因改造中的應用CRISPR/Cas系統的作用特性與限制性核酸內切酶相似，它對序列的特異性切割主要依賴于crRNA與Cas蛋白形成的核糖核蛋白復合物識別靶序列上的PAM（ Protospacer-adjacent Motif ）以及protospacer發現tracrRNA對靶點的識別和切割是必需的，tracrRNA的5端與成熟的crRNA 3端

16、有部分序列(約13 bp)能夠配對進而形成莖環結構，對維持crRNA與靶點的配對可能十分重要 根據tracrRNA與crRNA的結構特性，他們tracrRNA和crRNA表達為一條嵌合的向導RNA (guide RNA，gRNA)，并在體外證明gRNA可以發揮tracrRNA和crRNA的功能CRISPR/Cas系統有三類，其中Type型系統的核糖核蛋白復合物相對簡單，除crRNA和tracrRNA外，只有Cas9一個蛋白 目前，產膿鏈球菌(SF370)的Type型系統（CRISPR/Cas9）是被改造的最為成功的人工核酸內切酶，已經在人類細胞 小鼠 斑馬魚中成功實現了基因組定點修飾。CRIS

17、PR/Cas9系統的成功應用案例系統的成功應用案例2013年1月29日在nature biotechnology上發表的RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISER-Cas systems一文中，作者利用CRISER-Cas systems用設計好的DNA莫版替換相應基因來達到定點修飾2013年1月29日在nature biotechnology上發表的efficient genome editing in zebra fish using a CRISER-Cas system一文中，作者利用人工合成的sgRNAs能指導Cas9內源

18、性核酸酶對斑馬魚胚胎基因進行修飾2013年2月15日在science上發表的Multiplex Genome Engineering UsingCRISPR/Cas Systems一文中，作者利用一個包含兩個靶向不同的spacers的crRNA實現了同時對兩個基因進行編輯2013年4月12日在cell stem cell上發表的Enhanced Efficiency of Human Pluripotent Stem Cell Genome Editing through Replacing TALENs with CRISPRs一文中，作者利用TALENs和CRISPRs對同一基因進行修飾，

19、效率分別為0%-34%和51%-79% ZFN，TALEN，CRISPR/Cas9 的比較的比較均由自然界存在的核酸酶系統改造而來均具有識別核酸堿基特異性的結構域發揮作用的機制：均通過在細胞基因組創造雙鏈斷裂缺口， 從而誘發細胞自身修復機制完成基因修飾Differences of ZFN, TALEN and CRISPR/Cas9ZFNTALENCRISPR/Cas9系統大小1 kb 2 3 kb 2 4.2 kb (Cas9 from Streptococcus pyogenes) + 0.1 kb (sgRNA) 識別模塊Zinc-finger proteins Transcriptio

20、n activator-like effectorscrRNA or sgRNA 識別序列長度1836 bp3040 bp 22 bp (total length 23 bp) 識別序列限制性G-rich Start with T and end with A (owing to the heterodimer structure) End with an NGG or NAG (lower activity) sequence (that is, PAM) 切割模塊FokIFokICas9切割效率Low or variable (10%) High (20%) High (20%) 脫靶效應High Low Variable 細胞毒性Variable to high LowLowCRISPRCRISPR/ /Cas9Cas9技術的優勢技術的優勢p 而且從實際應用的角度來說，CRISPRs比TALENs更容易操作，因為每一對TALENs都需要重新合成，而用于CRISPR的gRNA只需要替換20個核苷酸就行。p 只需合成一個sgRNA就能實現對基因的特異性修飾，Cas蛋白不具特異性。p 編碼sgRNA的序列不超過100bp，因此比構TALENs和ZFNs更簡單方便。p 較短的sgRNA序列也避免了超長、高度重復TALENs編碼載體