1、載體構(gòu)建載體構(gòu)建 戎浩戎浩 2015.12 2015.12CONTENTS1 載體簡介2 載體構(gòu)建3 注意事項4 常見問題目錄1.載體簡介 目的基因的克隆與鑒定目的基因的克隆與鑒定載體構(gòu)建載體構(gòu)建大腸轉(zhuǎn)化大腸轉(zhuǎn)化，質(zhì)粒，質(zhì)粒提取與提取與鑒定鑒定農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化與活化農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化與活化外植體制備外植體制備浸浸 染染篩選篩選共培養(yǎng)共培養(yǎng)移栽移栽繼代繁殖繼代繁殖分子檢測分子檢測生理檢測生理檢測純化純化1.1載體 載體（vector） ，能將外源DNA或基因片段攜帶入宿主細(xì)胞內(nèi)的一個具有自我復(fù)制能力的DNA分子。1.2載體的分類質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體 質(zhì)粒載體是一種相對分子質(zhì)量較小、獨立于染色體DNA之外的環(huán)狀

2、DNA(一般有1200 kb左右)，有的一個細(xì)菌中有一個，有的一個細(xì)菌中有多個。質(zhì)粒能通過細(xì)菌間的接合由一個細(xì)菌向另一個細(xì)菌轉(zhuǎn)移，可以獨立復(fù)制，也可整合到細(xì)菌染色體DNA中，隨著染色體DNA的復(fù)制而復(fù)制。 噬菌體載體噬菌體載體 利用噬菌體作載體，主要是將外來目的DNA替代或插入中段序列，使其隨左右臂一起包裝成噬菌體，去感染大腸桿菌，并隨噬菌體的溶菌繁殖而繁殖。1.2載體的分類病毒載體病毒載體 感染動物的病毒可改造用作動物細(xì)胞的載體。由于動物細(xì)胞的培養(yǎng)和操作較復(fù)雜、花費也較多，因而病毒載體構(gòu)建時一般都把細(xì)菌質(zhì)粒復(fù)制起始序列放置其中。使載體及其攜帶的外來序列能方便地在細(xì)菌中繁殖和克隆，然后再引入真

3、核細(xì)胞。 現(xiàn)在人們還在不斷尋找新的載體，如葉綠體或線粒體DNA也有可能成為載體。1.2載體的分類 克隆載體克隆載體 中間載體中間載體 卸甲載體卸甲載體 表達載體表達載體一一元表達載體元表達載體雙雙元表達載體元表達載體1.2載體的分類植植物物基基因因工工程程載載體體1.2載體分類克隆載體 可攜帶出入的外源DNA片段并可轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞中大量擴增的DNA分子。通常含有篩選標(biāo)記，在插入外源的基因的時候不會破壞載體本身的自我復(fù)制功能。1.2載體分類中間載體1.2載體分類卸甲載體 野生型的Ti質(zhì)粒不能直接作為基因工程的載體，期T-DNA區(qū)存在一段阻礙細(xì)胞分化和植株再生的基因Onc，將其切除，即“解除”其“武

4、裝”，因此稱為卸甲載體。1.2載體分類雙元表達載體 一般植物表達載體是成套使用的，一套中有兩個，一個是帶有可以供插入外源表達基因的MCS和篩選標(biāo)簽的融合蛋白（通常是GFP，GUS或抗性基因蛋白）的普通表達載體。另一個載體就是雙元表達載體。1.2載體的功能運送外源基因高效的轉(zhuǎn)入到受體細(xì)胞中為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力 為外源基因的擴增或表達提供條件1.3載體應(yīng)具備的條件具有對受體細(xì)胞的可轉(zhuǎn)移性具有與特定受體細(xì)胞相適應(yīng)的復(fù)制位點或整合位點具有多種單一的酶切位點具有合適的選擇性標(biāo)記2.載體構(gòu)建（酶切連接）目的基因獲得農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化連接大腸桿菌轉(zhuǎn)化引物設(shè)計酶切質(zhì)粒提取大腸桿菌轉(zhuǎn)化目的片段擴增TA克隆P

5、CR產(chǎn)物純化 依賴于限制性核酸內(nèi)切酶，DNA連接酶和其他修飾酶的作用，分別對目的基因和載體DNA進行適當(dāng)切割和修飾后，將二者連接在一起，再導(dǎo)入宿主細(xì)胞，實現(xiàn)目的基因在宿主細(xì)胞內(nèi)的正確表達。2.1目的基因的獲得從NCBI或者相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫，文獻等等獲得。2.3 PCR 為獲得和目的基因完全相同的序列，一般使用高保真酶進行目的片段的擴增。（加尾）2.2引物設(shè)計（合適的酶切位點）2.4 PCR產(chǎn)物純化瓊脂糖凝膠電泳切膠回收（方法參照試劑盒）目的片段1.避免一些非特性條帶2.防止PCR體系中一些成分對轉(zhuǎn)化的影響2.5 TA克隆 聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物的克隆載體，線性化后兩側(cè)3端各多出一個脫氧胸苷酸(T)。由于

6、PCR產(chǎn)物兩側(cè)3端通常含單個脫氧腺苷酸(A)，與T載體（pMD19）之間的A-T互補，因此稱為TA克隆。 體系： T載體 0.5 L 目的片段 4.5 L Solution I 5.0 L16，8h2.6 大腸桿菌轉(zhuǎn)化 2.7 質(zhì)粒提取體系：限制性核酸內(nèi)切酶 2.5 L 10 buffer 5.0 L 質(zhì)粒 20 L ddH2O to 50 L 對pMD19-目的基因和表達載體（如PSB130）分別進行酶切2.8 酶切37，2h2.9 連接體系：T4連接酶 0.5 L T4 buffer 1.0 L 表達載體 1.0 L 目的片段 7.5 L16，8h2.10 大腸肝轉(zhuǎn)化2.11 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化3

7、.載體構(gòu)建（同源重組）目的基因獲得農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化大腸桿菌轉(zhuǎn)化引物設(shè)計LR反應(yīng)質(zhì)粒提取大腸桿菌轉(zhuǎn)化目的片段擴增BP反應(yīng)PCR產(chǎn)物純化3.1目的基因的獲得從NCBI或者相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫，文獻等等獲得。3.2引物設(shè)計加attB的接頭，對讀碼框3.4 PCR產(chǎn)物純化瓊脂糖凝膠電泳切膠回收（方法參照試劑盒）目的片段1.避免一些非特性條帶2.防止PCR體系中一些成分對轉(zhuǎn)化的影響3.3 PCR 為獲得和目的基因完全相同的序列，一般使用高保真酶進行目的片段的擴增。（加尾）3.5 BP反應(yīng)3.6 大腸桿菌轉(zhuǎn)化 3.7 質(zhì)粒提取3.8 LR反應(yīng)3.10 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化3.9 大腸桿菌轉(zhuǎn)化4.注意事項PCR產(chǎn)物可短時間在-20

8、保存，使用時可以取出進行后續(xù)實驗；在細(xì)胞轉(zhuǎn)化時，冰浴和熱激要嚴(yán)格控制好時間；連接反應(yīng)是DNA重組過程中的關(guān)鍵步驟，其成敗的重要參數(shù)之一就是溫度，因此要控制好連接溫度。進行黏末端連接時，會產(chǎn)生一定數(shù)量的載體自身環(huán)化分子，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化菌中過高的假陽性克隆背景。針對這一問題，常采用牛小腸堿性磷酸酶（CIP）去掉載體的5-磷酸以抑制DNA片段的自身環(huán)化。5.常見問題克隆基因的酶切位點及引物問題 1、單酶切 單酶切后進行連接，質(zhì)粒自連、目的片段自連、目的片段之間連接、目的片段和載體各種錯誤連接、目的片段反向連接等等，盡量不選單酶切 2、保護堿基數(shù)目的問題。 在設(shè)計PCR引物時，引入酶切位點后，常常要加入保護

9、堿基，這會使得酶切效率大大提高。5.常見問題 3、雙酶切引物設(shè)計 a、所選的酶切位點必須是載體上的，而目的片段中沒有的。 b、酶切位點不能太近，靠的太近的話，一般只能切開一個。 c、兩個酶切位點最好不要是同尾酶（效果相當(dāng)與單酶切）。 d、最好使用相同buffer的酶 e、使用實驗室已有的酶5.常見問題目的片段的擴增失敗 1、無條帶 引物設(shè)計錯誤； 退火溫度不合適，設(shè)置梯度，選擇最適退火溫度 2、條帶不單一 引物不特異，適當(dāng)增長引物序列長度； 適當(dāng)提高退火溫度 5.常見問題載體酶切的問題 1、酶切質(zhì)粒濃度和純度要好 2、酶切溫度和時間 如果兩個酶的最適溫度不同，建議單酶切，回收后在用另一個酶切，

10、時間最好過夜切。 3、沒有切開 可能是酶失活，建議酶切時增加陽性對照，確定酶是否好用 5.常見問題連接過程中的問題1、連接時間和溫度：一般16，2個小時就可以了，如果后續(xù)實驗檢測陽性克隆較少，可采用16過夜連接提高連接成功率； 2、未避免后續(xù)菌落PCR的假陽性情況，建議連接轉(zhuǎn)化時做對照組：酶切后的載體做自連接對照，如果對照組與實驗組長出的克隆數(shù)相差不大則很可能存在載體自連或者沒完全切開的情況，重新酶切，增加酶量及酶切時間、適當(dāng)減少所切載體的量、改變連接比等；如果對照組沒有克隆形成或鮮有克隆形成，則可繼續(xù)進行后續(xù)驗證。 5.常見問題菌落PCR 為了方便發(fā)現(xiàn)問題，菌落PCR要設(shè)置陽性對照組（原始目

11、的片段做模板）和陰性對照組（以雙蒸水為模板） 1、多次PCR均無陽性克隆存在 假陽性過高，可能是由于抗性失效，建議換培養(yǎng)皿； 2、陰性對照組也有條帶 可能是因為引物或其他試劑被模板污染了，建議跟換試劑，酒精擦拭PCR儀； 3、陽性對照也無條帶 酶失活或者其它試劑發(fā)生問題或忘記添加，重新?lián)Q試劑PCR鑒定 鑒定為陽性的克隆記得保存原菌液，避免后續(xù)轉(zhuǎn)化過程發(fā)生突變而丟失連接成功的克隆。M + - 1 2 3 4 M + -M + -5.常見問題表達鑒定 有的克隆前面的步驟都正確，可就是不表達 1、有的載體質(zhì)粒為單順反子，且啟動子位于多克隆位點之后，這種情況要求在擴增目的片段時引物要含有起始密碼子，否則是無法表達出相應(yīng)蛋白的。 2、注意表達細(xì)胞系的狀態(tài)