1、氨基酸的紙層析法分離目的和要求掌握分配層析的原理，學習氨基酸紙層析法的操作技術 (包括點樣、平衡、展層、顯色、鑒定及定量)。學習未知樣品的氨基酸成分(水解、層析及鑒定)分析的方法。原理層析法又叫色層分離法、色譜分析法或色譜法。 1903年俄國化學家茨維特(HBeT)發現用揮發油沖洗菊粉柱時，各種顏色的色素在吸附柱上從上到下排列成色譜，故稱“色層分離法”。1931年有人用氧化鋁柱分離了胡蘿卜素的兩種同分異構體，顯示了這一分離技術的高度分辯力，從此引起了人們的廣泛注意。自1944年應用濾紙作為固定支持物的“紙層析”誕生以來，層析技術的發展越來越快，五十年代開始，相繼出現了氣相色譜和高壓液相層析，其

2、它如薄層層析、親合層析、凝膠層析等也迅猛發展。層析分離技術操作簡便，樣品用量可大可小，既可用于實驗室分離分析，又適用于工業生產中產品的分析制備。現已成為生物化學、分子生物學、生物工程等學科廣泛應用而又必不可少的分析工具之一。根據所用的支持物及其理化性質不同可將層析法分成三類： 1.用固體吸附劑做支持物的稱吸附層析；2.用吸附了某種溶劑的固體物質(如濾紙)做支持物的稱為分配層析；3.用其表面所含離子能與溶液中的離子進行交換的固體物質做支持物的稱為離子交換層析。紙層析所依據的原理是分配層析，故屬于分配層析的范疇。一、分配層析分配層析法是利用不同的物質在兩個互不相溶的溶劑中的分配情況不同而使之得到分

3、離的方法。將分配層析法中的一種溶劑設法固定在一個柱內，再用另外一種溶劑來沖洗這個固定柱，同樣可達到將不同物質分離的目的。我們把固定在柱內的液體稱為固定相，把用作沖洗的液體叫做流動相。為了使固定相固定在柱內，需要有一種固體物質把它吸牢，這種固體物質本身對分離不起什么作用，對溶質也幾乎沒有吸附能力，稱為支持物。進行分離時由于被分離物質的組分在兩相中的分布不同，因此當流動相移動時，不同組分移動的速度也不相同。易溶于流動相中的組分移動快，在固定相中溶解度大的組分移動就慢，于是得到分離。分配層析法中不同溶質的分離取決于其在兩相 (固定相和流動相)間分配系數的不同，分配系數 () 的定義是： =溶質在固定

4、相的濃度(CS)/溶質在流動相的濃度(CL)濾紙層析法是以濾紙作為惰性支持物的分配層析。濾紙的成份是纖維素，纖維素的 OH基為親水性基團，因此可吸附一層水或其它溶劑作為固定相。通常把有機溶劑作為流動相。當將溶質樣品(被分離物)點在濾紙的一端后，該物質溶解在吸附于支持物上的水分子或其它溶劑分子的固定相中，有機溶劑作為流動相自上而下移動，稱為下行層析；反之，使有機溶劑自下而上移動，稱為上行層析。流動相流經支持物時與固定相對溶質進行連續的抽提，物質在兩相間不斷分配的結果即得到分離。濾紙層析原理還可進一步解釋如下：可以把濾紙看成一個層析柱，又可把柱看成由許許多多連續的板層構成。如果有A、B兩物質，A的

5、分配系數 =1，B的分配系數 =1/3，又設固定相為S，流動相為M，兩相互相接觸而不相混溶，則當第一層流動相中加入單位量A、B兩物質后，溶質根據一定分配系數在第一層的兩相中分配(圖10-1(1)。流動相繼續向下層移動，固定相與新流下的流動相之間進行第二次分配，原來第一層流動相與第二層固定相間進行分配如此類推，經三次分配即可看出A、B最濃部分已經分開，A物質在第二層最濃，而B物質則在第三層最濃。如此繼續抽提下去、再經若干次后，A和B兩物質就可以完全分開。顯然，A、B兩物質分配系數相差越大，則越易分開。物質分離后在圖譜上的位置，可用比移值 Rf來表示，Rf值的定義是：從溶質層析的起點(原點)到層析

6、斑點中心的垂直距離與從原點到溶劑流動的前沿的垂直距離的比值：Rf=原點到層析點中心的距離/原點到溶劑前沿的距離兩相體積比在同一實驗情況下是不變的，所以 Rf值的主要決定因素是分配系數 ( )。對于每一物質在一定條件下值是固定的，因此Rf值為其特征常數，可做為定性鑒定的參考數值。二、影響 Rf值的主要因素1.物質結構對于Rf值的影響：“物以類聚”，極性物質易溶于極性溶劑(水)中，非極性物質易溶于非極性溶劑(有機溶劑)中。所以物質的極性大小決定了物質在水和有機溶劑之間的分配情況。例如酸性和堿性氨基酸極性大于中性氨基酸。所以前者在水(固定相)中分配較多，因此Rf值低于后者。2.溶質與溶劑間的相互作用

7、對Rf值的影響：這種影響是由溶質與溶劑間的相互作用與分配系數的關系所決定的。溶質與溶劑之間若能形成氫鍵，對分配系數的影響就很大。例如酚、三甲基吡啶、氨等和水混合后都能很好地與溶質形成氫鍵。某些溶劑(例如酚，正丁醇等)是質子的供給體，而水既是質子的供給體又是質子的接受體。當溶質結構中增加能接受質子的基團(例如NH )時，因酚與水都能給 NH 基提供質子，所以酚和水兩相對接受質子的基團的引力，基本上是一致的，因此當溶質結構中增加氨基時，該物質與酚和水的作用對其在酚和水兩相間的分配影響不大，對Rf值影響較小。又例如當有機溶劑是質子的接受體(如三甲基吡啶，NH 3 等)，而溶質也是質子的接受體(如-N

8、H 基)，這時有機溶劑對-NH 沒有引力，而水卻有引力，于是水的引力就大于有機溶劑，因此溶質就被水拉向水相，對Rf值的影響就大。3.pH對Rf值的影響：這種影響主要是由pH與分配系數的關系所決定的。弱酸與弱堿的解離度受pH影響很大，解離度越大，極性越強，極性強的物質在兩相溶劑中分配時，偏向于極性強的一相，這樣，改變pH就會同時改變分配系數，從而使Rf也會相應變化。在氨基酸的層析法中，改變溶劑的pH，使酸性和堿性氨基酸的Rf值變動較大，而中性氨基酸的Rf值變動較小。在正丁醇中加甲酸，可使酸性氨基酸的極性降低，從而使Rf值變大，而使堿性氨基酸的Rf變小。反之，如在正丁醇中加氨，可使天冬氨酸和谷氨酸

9、的Rf值變小，而使賴氨酸、精氨酸等堿性氨基酸的Rf值變大。4. 濾紙對Rf值的影響：濾紙本身的pH及含水量對Rf值的影響很大，所以不同的濾紙得到不同的Rf值及不同的斑點形狀。紙上含水量的多少隨溶劑與紙對水的親和力的大小而異，質地不均一的濾紙常使溶劑擴展不一致，隨著纖維的紋理流動紊亂，另一方面紙的含水量不均一，也不能得到理想的分離效果。5.溫度對 Rf值的影響： Rf值的重現性與恒溫情況的好壞有密切關系。溫度對Rf 值的影響主要是因為溶質在固體相與流動相之間的分配隨溫度的變化而不同。隨各溶劑組分的粘度和表面張力的不同其蒸發能力也不同，因此有些溶劑系統對溫度的敏感程度強些，有些則差些。敏感程度強的

10、對溫度的要求就嚴格，敏感程度差的對溫度的要求就不太嚴格。溫度改變使溶劑系統中的溶解度改變，所以 Rf值也改變。一般層析展層是在恒溫室中進行的，室溫可在20至40，溫度改變不超過±0.5。無色物質的層析圖譜可用光譜法 (如核苷酸類物質用紫外光照射)或顯色法鑒定。氨基酸紙上層析圖譜常用的顯色劑有茚三酮、吲哚醌。本實驗采用茚三酮為顯色劑。茚三酮顯色反應受溫度、pH，時間影響較大。如果要使結果重復，必須嚴格控制上述條件。樣品中如含有大量鹽酸會使氨基酸不顯出顏色。樣品中含大量鹽時顯色點上會出現白斑，空氣中其它的雜質如氨，硫化氫或酚等皆會影響顯色結果。銅離子可以與氨基酸-茚三酮顯色物形成絡合物，

11、顏色較穩定，用硫酸銅乙醇溶液洗脫層析后的顯色斑點，可以通過比色法定量測定氨基酸含量。由于紙上層析設備條件較簡單，操作比較簡便，并可以分離微量樣品，因此紙層析方法已成為生化分析和研究的主要方法之一，廣泛應用于氨基酸、肽、核苷酸，糖、維生素以及脂肪酸等的分離鑒定。操作步驟一、標準氨基酸紙上層析1.單向上行層析(1)氨基酸 Rf值的測定濾紙：選用國產新華 1號濾紙(若有較多的樣品需在紙上分離，可采用新華3號濾紙)，戴上橡皮手套，將濾紙裁剪成28cm×28cm，在距紙邊2cm處，用鉛筆輕輕劃一條線，于線上每隔3cm處畫一小圓圈作為點樣處，圈直徑不超過0.5cm。點樣：點樣要合適，樣品點的太濃

12、，斑點易擴散或拉長，以致分離不清，氨基酸的點樣量以每種氨基酸含 520g為宜，將準備好的濾紙懸掛在點樣架上，濾紙垂直桌面，用點樣管(也可用血色素管代替)吸取氨基酸樣品10g(1g/L)，與濾紙垂直方向輕輕碰觸點樣處的中心，這時樣品就自動流出。點樣的擴散直徑控制在0.5cm之內，點樣過程中必須在第一滴樣品干后再點第二滴，為使樣品加速干燥，可用一加熱裝置(如吹風機或燈泡)，但要注意溫度不可過高，以免氨基酸破壞，特別是谷氨酰胺破壞，影響定量結果。將點好樣品的濾紙兩側比齊，用線縫好，揉成筒狀。注意縫線處紙的兩邊不要接觸。避免由于毛細管現象使溶劑沿兩邊移動特別快而造成溶劑前沿不齊，影響Rf值。本實驗做兩

13、張單向層析譜，每張點 6種氨基酸。一張測定酸系統中的Rf，一張測定堿系統中的Rf。展層：將揉成圓筒狀的濾紙放入培養皿內 (注意濾紙不要碰皿壁)，周圍放三個小燒杯，內盛平衡用的溶劑。蓋好鐘罩，平衡12h(每個鐘罩內可放三個培養皿)。平衡后，打開鐘罩上塞子，用長頸漏斗。插入罩內，使管下口碰皿底，沿管加入展層溶劑，然后迅速取出漏斗(注意勿使它碰紙)。當溶劑展層至距離紙的上沿約1cm時，取出濾紙，立即用鉛筆標出溶劑前沿位置，掛在繩上或點樣架上晾干，使紙上溶劑自然揮發，直至除凈溶劑。酸溶劑系統：正丁醇： 80%甲酸：水=15:3:2(體積比)，平衡溶劑與展層溶劑相同。溫度25，時間1020h。堿溶劑系統

14、：正丁醇：12%氨水：95%乙醇=13:3:2(體積比)，平衡溶劑為12%氨水，溫度25，時間1416h。注意，使用的溶劑系統需新鮮配制，并要搖勻。平衡溶劑每燒杯放 10mL左右，展層溶劑每張約需25mL。顯色：將已除盡溶劑的層析濾紙平夾在層析架上，將架與地面略平行，用噴霧器將 0.5%茚三酮無水丙酮溶液均勻地噴在紙上。試劑內不可含水，否則會把樣品沖散以致圖譜模糊，每張紙共用顯色劑25mL，分別在兩面噴霧，濾紙充分晾干后，置65鼓風箱中30min，鼓風保溫，濾紙上即顯出紫紅色班點。Rf 值的計算：用尺測量顯色斑點的中心與原點(點樣中心)之間的距離和原點到溶劑前沿的距離，求出此值，即得氨基酸的R

15、f值。或用一特制的橡皮尺直接讀出Rf 值。尺的制作方法如下：取細乳膠管一段，畫上刻度，每大格為1cm，每小格為1mm(圖10-4)。測量時將原點與刻度“0”比齊，再拉長橡皮小尺，使溶劑前沿與“10”比齊，讀出斑點中心所在的刻度即得Rf值。計算出 6種氨基酸在酸、堿系統中的Rf值。(2)氨基酸標準曲線的制作濾紙：規格、尺寸與前同。點樣：配制一個濃度為 8mmol/L分子的天冬氨酸溶液，在紙上點上不同的量：5、10、15、20l，留一空白點作對照。點樣操作與前同。展層：展層采取酸性溶劑系統，即正丁醇： 80%甲酸：水=15:3:2,展層條件與操作見前。顯色：除盡溶劑的層析紙用 20mL茚三酮丙酮溶

16、液在紙的一面均勻噴霧，自然干燥后，置于65烘箱內，準確地烘30min，取出。定量測定：剪下層析譜上天冬氨酸斑點，其面積大小相仿，再剪一塊空白紙作比色對照。把剪下的紙片再剪成梳狀細條，分別裝入干燥試管內，加入 5mL0 1%硫酸銅(CuSO 4 ·5H 2 O)：75%乙醇=2：38的溶液洗脫，間歇搖勻，洗脫液呈粉紅色，待15min后用520mm處測定O D值。以氨基酸含量(g數)為橫坐標，光吸收值為縱坐標作圖，其結果應為直線關系，但不同氨基酸其斜率不同。2.雙向上行紙層析點樣：樣品為混合標準氨基酸，點樣量 15或20l。展層：雙向展層。第一向為堿系統正丁醇： 12%氨水：95%乙醇=

17、13:3:3(體積比) 第二向為酸系統正丁醇： 80%甲酸：水=13:3:2(體積比) 第一向展層一次，必要時亦可展層兩次，第二向一般展層一次即可。二向的展層條件分別與酸、堿單向展層的條件相同。進行雙向層析時，先用第一向溶劑展層后，使干燥，將紙調轉 90°，再用第二向溶劑展層。顯色：顯色劑采用 0.5%茚三酮溶液。顯色條件與標準曲線制作顯色部分相同。定性鑒定與定量測定：雙向層析Rf值由兩個數值組成，即在第一向計量一次(堿系統)和在第二向計量一次(酸系統)，分別與已知氨基酸在酸、堿系統的Rf值對比，即可初步肯定它為何種氨基酸。找出谷氨酸斑點，將它剪下，在同一張紙上再剪下一塊大小相仿的空

18、白紙作對照，如前所述，用硫酸銅乙醇溶液洗脫并進行比色測定，所得比色讀數在標準曲線上查出谷氨酸含量，計算出樣品中谷氨酸的毫克分子數是多少? 二、樣品中氨基酸的分析 (以雞蛋蛋清為例) 1.水解液的制備：取雞蛋清1滴(約0 2mL)，加到2mL的安瓿中，再加入2mL經過重蒸的鹽酸溶液(57mol/L)，封口后置于110烤箱中進行封管酸水解。24h后打破安瓿。將酸水解液轉移到小燒杯中，于沸水浴上蒸去鹽酸，內容物蒸干時可加少量蒸餾水，再次蒸發，重復34次。最后加1mL蒸餾水。2.單向上行紙層析分析點樣：在濾紙上 (規格尺寸同圖10-5)。點上不同體積：10、20、25、30l的蛋清酸水解液，同時再點上

19、一個標準氨基酸混合液點(15l/點)。操作同前展層：條件同前。采取正丁醇： 80%甲酸：水=15:3:2系統，操作同前。顯色： 0.1%茚三酮丙酮顯色，操作同前。層析譜：雞蛋清水解液展層后一般可以分出 1013個氨基酸斑點。找出那一種點樣量的層析效果最好，并用六種標準氨基酸混合液的層析斑點及文獻資料上關于雞蛋清蛋白水解液的成分作比較。3.此實驗中應注意的幾個問題(1)使用茚三酮顯色法，必須在整個層析操作中避免手直接接觸層析紙，因為手上常常有少量含氮物質。顯色時它也呈現紫色斑點。污染了層析結果，因此操作時應戴橡皮手套或指套。同時也要防止空氣中的氨。(2)取一支破損的0.1mL吸量管，將下端拉成毛

20、細管，然后在碎磁片邊緣上磨尖。注意，在點樣時應盡量使用上端的刻度，因為靠近尖端的刻度已不準確。(3)層析紙經第一向層析后，上端未經溶劑走過的濾紙(距紙邊約1cm)與已被溶劑走過的部分形成一個分界線，進行第二向層析前，需將第一向上端截去約2cm除去邊緣，在截去邊緣以前，先將原點到溶劑前沿的距離量好，記下來。(4)為了鑒定未知樣品中某幾種氨基酸的存在，僅用一種溶劑系統展層是不夠的。一船應采用23種溶劑系統展層顯色后，再分別與該種溶劑系統的標準氨基酸圖譜比較，相互印證，才能作出比較確切的結論。試劑和器材一、試劑1.氨基酸標準液(1mg/mL)：六種氨基酸是天門冬氨酸、丙氨酸、酪氨酸、蛋氨酸、胱氨酸、

21、亮氨酸、分別配制成上述濃度的溶液。2.8mmol/L天門冬氨酸溶液。3.95%乙醇。4.80%甲醇(稀釋前需測比重)。5.12%氨水(稀釋前需測比重)。6.0.1%茚三酮丙酮溶液。7.0.5%茚三酮丙酮溶液。8.氨基酸混合液(每種氨基酸500mg/mL)。9.正丁醇(需重蒸，沸程：116120)。10.0.1%硫酸銅(CuSO 4 ·5H 2 O)：75%乙醇=2：38溶液。硫酸銅難溶于乙醇，不能用乙醇直接配制。將硫酸銅溶液和乙醇混合后放置過久亦會產生沉淀，因此必須在臨用前按比例混合。重蒸鹽酸溶液：將商售化學純鹽酸用磨口蒸餾器蒸餾，收集恒沸點部分，即為5.7mol/L鹽酸溶液。12.

22、雞蛋蛋清。二、器材1.新華濾紙。2.培養皿(直徑115mm)。3.電熱鼓風干燥箱。4.恒溫水浴和沸水浴。5.72型分光光度計。6.離心機(4 500r/min)。7.研缽。8.噴霧器及吹風機。9.點樣管及點樣架。10.針、線、尺。11.橡皮手套。12.安培瓶(2mL) 13.燒杯(50mL)。14.鐘罩(高約430mm,直徑約290mm，具磨口塞)。思考題1.什么在展層時有時用一種溶劑系統，而有時用兩種溶劑系統? 2.性溶劑系統(或堿性溶劑系統)對氨基酸極性基團的解離有何影響? 3.酸性溶劑系統(或堿性溶劑系統)對堿性氨基酸(賴、精、組)和酸性氨基酸(天冬、谷)的Rf值有什么影響? 4. 濾紙

23、上點上 1 L l0.02mol/L 的甘氨酸 ( 分子量 =75) 溶液，請問實際上點了多少微克的氨基酸 ? 試科目名稱及代碼  生物化學 二適用專業   生物化學與分子生物學注意：1.所有答案必須在”南京大學研究生入學考試答題紙”上，寫在試卷和其他紙上無效。2.本科目不允許使用無字典存儲和編程功能的計算器。一. 是非題（對的畫”+”,錯的畫”-“,每題1分，共20分。答錯一題，倒扣0.5分，不答者不倒扣）1. 假尿苷分子中的堿基不是真正的尿嘧啶，而是尿嘧啶的衍生物。2. 腺嘌呤核苷酸是輔酶A，NAD+和FAD的組成成分。3. 維生素B5和維生素B6都

24、是吡啶的衍生物。4. 茚三酮試劑能測定蛋白質中的肽鍵的數量。5. DNA是生物的遺傳物質，而RNA則不是遺傳物質。6. 膠原蛋白是一種糖蛋白。7. 用甲醛滴定法測定氨基酸的含量時，甲醛的作用是使氨基酸的-NH3+酸性增強。8. 一種糖的D-型和L-型是對映體。9. 固定化酶的一個缺點是很難作用于水不溶性底物。10. 在結構上與底物無關的各種代謝物有可能改變一些酶的Km值。11. 生長因子的受體都具有酪氨酸蛋白激酶的活性。12. 脂溶性激素的受體實際上是一種反式作用因子13. 促黑激素和褪黑激素的本質上都是多肽14. NAD+在340nm處有吸收，NADH沒有，利用這個性質可將NADH與NAD+

25、區分開來。15. 琥珀酸脫氫酶的輔基FAD與酶蛋白之間與共價鍵結合，16. 嘧啶合成所需的氨甲酰磷酸合成酶與尿素循環所需要的氨甲酰磷酸合成酶是同一個酶。17. 羧化酶都需要生物素(Biotin)作為輔基。18. DNA聚合酶I，II和III都屬于多功能酶。19. HIV的基因組實際上是一種多順反子mRNA。二 選擇題（以下各題均有一個正確答案，錯答不倒扣，每小題1分，共18分）1. 從一種動物病毒中分離得到的DNA，顯示Chargaff堿基組成規律，并且能抗外切核酸酶，則此DNA為：（1）單鏈線狀  （2）單鏈環狀  （3）雙鏈線狀  

26、;（4）雙鏈環狀  2. 蛋白質的熱變性主要是：（1）破壞氫鍵   （2）破壞離子鍵   （3）破壞疏水鍵  （4）破壞水化層3. R-A-G在PH7.0時所帶的凈電荷為：（1）-1        （2）0         （3） +1       （4）+24. 當S=Km時，游離E和ES復合物濃度的關系為：（1）2E=ES    （2

27、）E=3ES  （3）E=ES   （4）1/2 E=ES5 熱變性DNA具有下列那種特性？（1） 核苷酸間的磷酸二酯鍵斷裂（2） 260nm處的光吸收下降（3） GC對的含量直接影響Tm值（4） 形成三股螺旋6 下列那種原因中，哪個會導致Hb與氧親和力下降？（1） 一分子氧和脫氧Hb分子四個結合部位中的一個結合（2） 一分子氧和脫氧Hb分子中亞基結合（3） 紅細胞內DPG濃度下降（4） 提高CO2的水平7.  下列有關膽固醇的敘述，哪個是錯誤的？（1） 有李一伯（Libermann-Burchard）反應（2） 是不飽和固醇（3）

28、是所有類固醇激素的前體（4） 膽固醇是脂類化合物，分子中含有脂酸基8 下列關于肌紅蛋白的敘述，哪個是錯誤的？（1） 肌紅蛋白是由一條多肽鏈和一個血紅素輔基組成的（2） 肌紅蛋白含有高比例的螺旋（3） 血紅素位于兩個His殘基之間（4） 大多數非極性側鏈位于分子表面，所以肌紅蛋白不溶于水     9能保護疏基酶不被氧化的物質是   （1）GSH   （2）尿素   （3） SDS  （4）FDNB10蛋白質分子典型的-螺旋，螺距為    （1）0.15nm&

29、#160;  (2) 0.34nm  (3)  0.45nm   (4) 0.54nm11NO作為一種信息分子，它在體內是由哪一種氨基酸轉變而來？     （1）Lys  （2）Arg   (3) Gln   (4) Asn  (5) His 12. 某一家族的與G蛋白偶聯的腺苷酸環化酶的基因有缺陷，試問下面哪一種激素的功能將會受到影響？   （1）甲狀腺素  （2）

30、皮質醇   （3）胰島素   （4）腎上腺素  （5）ANF13.Leland H.Hartwell, R.timothy Hunt  和 Paul M.Nurse三位科學家因在什么領域上的杰出貢獻而榮獲2001年度的諾貝爾醫學和生理學獎  (1)信號肽學說  (2)氧化磷酸化  (3)第二信使學說  (4)癌基因學說 (5)細胞周期14  蒼術苷能夠抑制氧化磷酸化是因為它直接作用  (1)復合體

31、I   (2)復合體II   (3)復合體III  (4)復合體IV   (5) ADP/ATP交換體15 大量口服Ile 可影響到小腸上皮細胞對哪一種氨基酸的吸收。   (1)Asp      (2) Lys    (3) Gly     (4)Pro     (5) Val16  尿嘧啶糖苷酶的功能是   (1)去

32、除嘧啶二聚體    (2)切除RNA分子的尿嘧啶   (3)切除DNA分子中的尿嘧啶   (4)切除DNA分子中的尿苷酸      (5)切除RNA分子中的尿苷酸17 雌激素反應元件（ERE）的一致序列為AGGTCAnnnTGACCT。如果將議該序列方向改變，則依賴雌激素的基因轉錄將受到什么樣的影響？   （1）只有3'-端的基因將被關閉   （2）只有5'-端的基因將被關閉     （3）5'

33、;-端3'-端基因都將被關閉    （4）對5'-端和3'-端基因都沒有什么影響    （5）由ERE編碼的所有氨基酸都將改變18  使用(UAG)作為模板在無細胞翻譯系統中進行翻譯，可得到幾種多肽？1、0種     2、1種     3 、2種    4 、3種    5、4種三填充題1.常見的蛋白質的超二級結構有_,_,_,-_,_,和_  2.測定蛋白質一級結構時，常

34、用的N端分析方法有(   )(   )(   )和(   )法。3.酶高效催化的假設有(   )(    )(     )(     )和(    )   4.雌激素的受體除了應具有與激素結合部位以外，還應該具有(    )(   )兩個功能部位  5.GTP的類似物GTP()CH2能夠延長腎上腺素

35、的作用時間是因為  6.OAA的P/O值(   )  7.(   )酶的缺乏可導致人患嚴重的復合性免疫缺陷癥(SCID)，使用(   )治療可治愈此疾病  8.體內DNA復制主要使用(    )作為引物，而在體外進行PCR擴增時使用(   )作為引物。  9.四環雙萜是(    )酶的抑制劑  10.維持DNA復制的高度忠實性的最重要的機制是(    )&#

36、160; 11.所有的真核細胞的RNA聚合酶II的最大亞基的C端都含有一段高度保守的重復序列，這段重復序列是(    ),它的功能可能是(    )  12.gRNA(guide RNA)的功能是(   )  13.分子伴侶通常具有(   )酶的活性。  14某些蛋白質基因的編碼鏈上并沒有終止密碼子，但是，可以通過Pre-mRNA的(   ),和(   )兩種后加工方式引入終止密碼子。  

37、;15.真核生物細胞蛋白合成對起始密碼子的識別主要通過(    )機制進行。窗體頂端      2007年1月9日 星期二 窗體底端第五章 酶化學發布日期：2005-12-18 發布人：管理員第五章 酶化學 一：填空題1.全酶由_和_組成，在催化反應時，二者所起的作用不同，其中_決定酶的專一性和高效率，_起傳遞電子、原子或化學基團的作用。2.輔助因子包括_，_和_等。其中_與酶蛋白結合緊密，需要_除去，_與酶蛋白結合疏松，可用_除去。3.酶是由_產生的，具有催化能力的_。4.酶活力的調節包括酶_的調節和酶_的調節。5.T.R.Cech和S.Al

38、tman因各自發現了_而共同獲得1989年的諾貝爾獎(化學獎)。6.1986年，R.A.Lerner和P.G.Schultz等人發現了具有催化活性的_，稱_。7.根據國際系統分類法，所有的酶按所催化的化學反應的性質可以分為六大類_，_，_，_，_和_。8.按國際酶學委員會的規定，每一種酶都有一個唯一的編號。醇脫氫酶的編號是EC1.1.1.1，EC代表_，4個數字分別代表_，_，_和_。9.根據酶的專一性程度不同，酶的專一性可以分為_專一性、_專一性和_專一性。10.關于酶作用專一性提出的假說有_，_和_等幾種。11.酶的活性中心包括_和_兩個功能部位，其中_直接與底物結合，決定酶的專一性，_是

39、發生化學變化的部位，決定催化反應的性質。12.酶活力是指_，一般用_表示。13.通常討論酶促反應的反應速度時，指的是反應的_速度，即_時測得的反應速度。14.常用的化學修飾劑DFP可以修飾_殘基，TPCK常用于修飾_殘基。15.酶反應的溫度系數 一般為_。16.調節酶包括_和_等。17.解釋別構酶作用機理的假說有_模型和_模型兩種。18.固定化酶的優點包括_，_，_等。19.固定化酶的理化性質會發生改變，如Km_，Vmax_等。20.同工酶是指_，如_。21.pH影響酶活力的原因可能有以下幾方面：(1)影響_，(2)影響_，(3)影響_。22.溫度對酶活力影響有以下兩方面：一方面_，另一方面

40、_。23.脲酶只作用于尿素，而不作用于其他任何底物，因此它具有_專一性；甘油激酶可以催化甘油磷酸化，僅生成甘油-1-磷酸一種底物，因此它具有_專一性。24.酶促動力學的雙倒數作圖(Lineweaver-Burk作圖法)，得到的直線在橫軸上的截距為_，縱軸上的截距為_。25.磺胺類藥物可以抑制_酶，從而抑制細菌生長繁殖。26.谷氨酰胺合成酶的活性可以被_共價修飾調節；糖原合成酶、糖原磷酸化酶等則可以被_共價修飾調節。27.判斷一個純化酶的方法優劣的主要依據是酶的_和_。二：是非題1. 酶可以促成化學反應向正反應方向轉移。2. 對于可逆反應而言，酶既可以改變正反應速度，也可以改變逆反應速度。3.

41、酶的化學本質是蛋白質。4. 酶活性中心一般由在一級結構中相鄰的若干氨基酸殘基組成。5. 酶只能改變化學反應的活化能而不能改變化學反應的平衡常數。6. 酶活力的測定實際上就是酶的定量測定。7. 酶反應速度一般用單位時間內底物的減少量來表示。8. 從鼠腦分離的己糖激酶可以作用于葡萄糖(Km= mol/L)或果糖(Km= mol/L)。則己糖激酶對果糖的親和力更高。9. Km是酶的特征常數，只與酶的性質有關，與酶濃度無關。10. Km是酶的特征常數，在任何條件下，Km是常數。11. Km是酶的特征常數，只與酶的性質有關，與酶的底物無關。12. 一種酶有幾種底物就有幾種Km值。13. 當S>&g

42、t; Km時，v 趨向于Vmax，此時只有通過增加E來增加v。14. 酶的最適pH是一個常數，每一種酶只有一個確定的最適pH。15. 酶的pH 酶活性曲線均為鐘罩形。16. 酶的最適溫度與酶的作用時間有關，作用時間長，則最適溫度高，作用時間短，則最適溫度低。17. 酶反應的溫度系數高于一般反應的溫度系數。18. 金屬離子作為酶的激活劑，有的可以相互取代，有的可以相互拮抗。19. 增加不可逆抑制劑的濃度，可以實現酶活性的完全抑制。20. 正協同效應使酶促反應速度增加。21. 正協同效應使酶與底物親和力增加。22. 正協同效應使酶促反應速度對底物濃度變化越來越敏感。23. 競爭性可逆抑制劑一定與酶

43、的底物結合在酶的同一部位。24. 由1克粗酶制劑經純化后得到10mg電泳純的酶制劑，那么酶的比活較原來提高了100 倍。25. 酶反應的最適pH只取決于酶蛋白本身的結構。26. 負協同性不能用MWC(齊變模型)理論來解釋。三：單選題1. 利用恒態法推導米氏方程時，引入了除哪個外的三個假設？A.在反應的初速度階段，E+PES可以忽略B.假設S>>E，則S-ESSC.假設E+SES反應處于平衡狀態D.反應處于動態平衡時，即ES的生成速度與分解速度相等2. 用動力學的方法可以區分可逆、不可逆抑制作用，在一反應系統中，加入過量S和一定量的I，然后改變E，測v，得vE曲線，則哪一條曲線代表加

44、入了一定量的可逆抑制劑？A.1B.2C.3D.不可確定3. 在一反應體系中，S過量，加入一定量的I，測vE曲線，改變I，得一系列平行曲線，則加入的I是： A.競爭性可逆抑制劑B.非競爭性可逆抑制劑C.反競爭性可逆抑制劑D.不可逆抑制劑E.無法確定4. 競爭性可逆抑制劑抑制程度與下列哪種因素無關？A.作用時間B.抑制劑濃度C.底物濃度D.酶與抑制劑的親和力的大小E.酶與底物的親和力的大小5. 下圖中I代表了：A.競爭性可逆抑制劑B.非競爭性可逆抑制劑C.反競爭性可逆抑制劑D.不可逆抑制劑E.無法確定6. 哪一種情況可用增加S的方法減輕抑制程度？A.不可逆抑制作用B.競爭性可逆抑制作用C.非競爭性

45、可逆抑制作用D.反競爭性可逆抑制作用E.無法確定7. 酶的競爭性可逆抑制劑可以使：A.Vmax減小，Km減小B.Vmax增加，Km增加C.Vmax不變，Km增加D.Vmax不變，Km減小E.Vmax減小，Km增加8. 下列常見抑制劑中，除哪個外都是不可逆抑制劑？A.有機磷化合物B.有機汞化合物C.有機砷化合物D.氰化物E.磺胺類藥物9. 溶菌酶在催化反應時，下列因素中除哪個外，均與酶的高效率有關？A.底物形變B.廣義酸堿共同催化C.鄰近效應與軌道定向D.共價催化E.無法確定10. 下圖中哪條曲線是負協同效應別構酶的vS曲線？A.1B.2C.3D.無法確定11. 假定Rs=(酶與底物結合達90%

46、飽和度時的底物濃度)/(酶與底物結合達10%飽和度時的底物濃度)，則正協同效應的別構酶:A.Rs>81B.Rs=81C.Rs<81D.Rs81E.Rs8112. 以Hill系數判斷，則具負協同效應的別構酶:A.n>1B.n=1C.n<1D.n1E.n113. 丙二酸對琥珀酸脫氫酶的影響屬于：A.反饋抑制B.底物抑制C.競爭性可逆抑制D.非競爭性可逆抑制E.反競爭性可逆抑制14. 酶的活化和去活化循環中，酶的磷酸化和去磷酸化位點通常在酶的哪一種氨基酸殘基上？A.天冬氨酸B.脯氨酸C.賴氨酸D.絲氨酸E.甘氨酸15. 測定酶活性時，通常以底物濃度變化小于多少時測得的速度為反

47、應的初速度？A.0.1%B.0.5%C.1%D.2%E.5%16. 在生理條件下，下列哪種基團既可以作為 的受體，也可以作為 的供體？A.His的咪唑基B.Lys的氨基C.Arg的胍基D.Cys的巰基E.Trp的吲哚基17. 對于下列哪種抑制作用，抑制程度為50%時，I=Ki？A.不可逆抑制作用B.競爭性可逆抑制作用C.非競爭性可逆抑制作用D.反競爭性可逆抑制作用E.無法確定18. 在一酶反應體系中，若有抑制劑I存在時，最大反應速度為 ，沒有抑制劑I存在時，最大反應速度為 ，若 ， 則I為：A.競爭性可逆抑制劑B.非競爭性可逆抑制劑C.反競爭性可逆抑制劑D.不可逆抑制劑E.無法確定四：問答題1

48、.簡述酶作為生物催化劑與一般化學催化劑的共性及其個性。2.簡述Cech及Altman是如何發現具有催化活性的RNA的。3.寫出催化下列反應的酶的分類名稱(類型)4.試指出下列每種酶具有哪種類型的專一性。(1)脲酶(只催化尿素 的水解，但不能作用于 ) (2)-D-葡萄糖苷酶(只作用-D-葡萄糖形成的各種糖苷，但不能作用于其他的糖 苷，例如果糖苷) (3)酯酶(作用于 的水解反應) (4)L-AA氧化酶(只作用于L-AA，而不能作用于D-AA) (5)反丁烯二酸水合酶只作用于反丁烯二酸(延胡索酸)，而不能作用于順丁烯二酸 (馬來酸) (6)甘油激酶(催化甘油磷酸化，生成甘油-1-磷酸)5.甘油醛

49、-3-磷酸脫氫酶，相對分子質量4萬，由4個相同亞基組成，每個亞基上有一個活性位點，在最適條件下，5g純酶制品每分鐘可以催化2.8mol甘油醛-3-磷酸轉化為甘油酸-3-磷酸。請計算酶的比活力和單個活性位點的轉換數。6.稱取25mg蛋白酶配成25ml溶液，取2ml溶液測得含蛋白氮0.2mg，另取0.1ml溶液測酶活力，結果每小時可以水解酪蛋白產生1500ug酪氨酸，假定1個酶活力單位定義為每分鐘產生1ug酪氨酸的酶量，請計算：(1)酶溶液的蛋白濃度及比活(2)每克酶制劑的總蛋白含量及總活力。7.Decamethonium 是一種用于肌肉松弛的藥物，是乙酰膽堿酯酶的抑制劑，這種抑制作用可以通過增加

50、乙酰膽堿的濃度來逆轉或解除。請問這種藥物是否與酶共價結合？屬于哪種類型的抑制劑？并解釋為什么可以通過增加乙酰膽堿的濃度來解除抑制。8.乙酰膽堿酯酶也可以被DFP失活，因為DFP可以與酶的Ser殘基共價結合，但是decamethonium可以對酶起保護作用。在一定量的酶和DFP存在時，decamethonium可以使酶失活的速度降低，請解釋。9.試比較Km與Ks的定義及其相互關系。10.Vmax和米氏常數可以通過作圖法求得，試比較vS圖，雙倒數圖，vv/S作圖，S/vS作圖及直接線性作圖法求Vmax和Km的優缺點。11.指出下列反應式分別代表了哪種機制的雙底物雙產物反應。 12.(1)為什么某些

51、腸道寄生蟲如蛔蟲在體內不會被消化道內的胃蛋白酶，胰蛋白酶消化？ (2)為什么蠶豆必需煮熟后食用，否則容易引起不適？13.-糜蛋白酶( 24 000)可以水解苯甲酰-L-酪氨酸乙酯。比活為45.0mol/min/mg 酶。已知-糜蛋白酶只有一個活性位點。求轉換數。14.-胰凝乳蛋白酶可以催化N-乙酰-L-Phe-p-硝基苯酯的水解，在不同的底物濃度下測反應初速度得到一組實驗數據，見下表。求Km和Vmax。15.使用下表數據，作圖判斷抑制劑類型(競爭性還是非競爭性可逆抑制劑)。16.甘油醛-3-磷酸脫氫酶( 150 000)的活性位點有一個Cys殘基，假定為使5ml1.2mg/ml的酶溶液完全失活

52、，需要 mg碘乙酰胺 ( 185)，計算酶的催化亞基的數目。17.對活細胞的實驗測定表明，酶的底物濃度通常就在這種底物的Km值附近。請解釋其生理意義。為什么底物濃度不是大大高于Km或大大低于Km呢？18.有時別構酶的活性可以被低濃度的競爭性抑制劑激活，請解釋。19.(1)對于一個遵循米氏動力學的酶而言，當S=Km時，若v=35mol/min，Vmax是多少mol/min？ (2)當S= mol/L,v=40mol/min，這個酶的Km是多少？ (3)若I表示競爭性抑制劑， = M,當S= mol/L和I= mol/L時,v是多少？ (4)若是非競爭性抑制劑，在 、 S和I條件與(3)中相同時，

53、v是多少？ (5)大致繪出此酶v-S關系的曲線圖形a.沒有抑制劑存在時；b.有競爭性抑制劑存在時如(3)；c.有非競爭性抑制劑存在時如(4)20.在不同底物濃度的反應體系中，分別測有無抑制劑存在時的v，數據如下：求有無抑制劑存在時的Vmax和Km(Km)，并判斷這種抑制劑是什么類型的抑制劑。21.在一組10ml的反應體系中，加入不同濃度的底物。分別測反應初速度，得數據如下：不作圖計算：(1)V和Km。(2) 計算 S = mol/L 和 S = mol/L 時的 v 。 (3) 計算 S = mol/L 或 S = mol/L 時最初 5 分鐘內的產物總量。 (4) 假如每一個反應體系中酶濃度

54、增加至 4 倍時， Km ， Vmax 是多少？當 S = mol/L 時， v 是多少？ 22.在很多酶的活性中心均有His殘基參與，請解釋。kkzj9891kkzj9891當前離線積分6考元12 元威望0 點精華0帖子6閱讀權限5注冊時間2008-8-2最后登錄2008-10-10實習會員實習會員, 積分 6, 距離下一級還需 14 積分· 串個門· 加好友· 打招呼· 發消息發表于 2008-8-2 20:47:11|只看該作者|倒序瀏覽2000年是非題1溶液的pH可以影響氨基酸的等電點。    (    )

55、5脂肪和膽固醇都屬于脂類化合物，它們的分子中都含有脂酸。    (    )6Phe-Leu-Val-Arg四肽的等電點在pH8.0以上。    (    )7雙鏈DNA中若G-C含量多，則Tm值高。    (    )9RNA容易被堿水解，DNA對堿穩定，這是由于它們所含的堿基不同。11cAmP作為一種第二信使，只存在于真核生物細胞。    (    )1302作為一種第二信使，需要通過鈣調蛋白才能發揮作用。   

56、 (    )    14在消耗ATP的條件下，呼吸鏈上的電子可以從復合物流動到復合物  I。    (    )  15大腸桿菌DNA聚合酶I并不是參與其染色體DNA復制的主要酶，因此它的缺失不會影響到大腸桿菌的繁殖。    (    )    16癌細胞和胚性細胞內的端聚酶活性較高，而正常的已經分化的細胞內的端聚酶活性則很低。    (    )  17

57、四膜蟲pre-rRNA的剪接反應需要鳥苷酸提供能量。    (    )  18由于遺傳密碼的通用性，所以真核生物的mRNA可以在原核生物細胞內得到正常的翻譯。    (    )  19信號肽總是處在多肽前體的N端。    (    )  20與核糖體蛋白相比，rRNA僅僅作為一種結構骨架，在多肽合成中沒有什么直接作用。    (    )  二、選擇題(

58、從4個備選答案中選出1個惟一的正確的答案，將答案代碼填人題末的括號內。每小題1分，共20分)        1在丁醇乙酸水溶劑系統中進行紙層析時，發現氨基酸的m值太小，為了使Rf值加大，應在    (  )    (1)層析缸中多加一些展層劑    (2)溶劑系統中加大丁醇的比例    (3)溶劑系統中加大乙酸的比例    (4)溶劑系統中加大水的比例    2下列化合物中哪一組所標的名稱是正確的?  &#

59、160; (    )    (1)磷酸吡哆醛維生素B2衍生物    (2)抗壞血酸維生素E的衍生物    (3)硫胺素維生素B1衍生物    (4)核黃素維生素B5衍生物    3酶分子中一個活性出現上重要的但在催化過程中不大可能直接與底物相互作用的氨基酸為    (  )    (1)Glu  (2)Cys  (3)His  (4)Set  &

60、#160; 4從某組織提取液中提純一種酶，最理想的是酶制品的    (  )    (1)蛋白質含量高  (2)活力單位數最高  (3)比活力最高  (4)Km值最小    5CTP對ATCase的別構效應被稱為    (  )    (1)同促激活    (2)同促抑制    (3)異促激活    (4)異促抑制   

61、; 6當有180個氨基酸殘基的蛋白質多肽鏈形成完整的螺旋時，其總長度為    (    )    (1)54nm(2)27nm(3)25nm(4)12nm    7酶之所以能加速反應速度，并不是因為    (  )    (1)是反應物集中于酶分子  (2)是反應物的鍵適當定向    (3)利用肽鍵的能量使反應活化能下降  (4)提供酸堿側鏈作為質子供體和受體    8能保護巰基酶不被氧化的物質是    (  ，)    (1)GSH  (2)尿素  (3)SDS  (4)FDNB    9KAG三肽在pH70時所帶靜電荷為    (  ：)    (1)十2  (2)+1  (3)0  (4)一1    10用RNaseTl處理下面寡聚核苷酸時，將在何處發生