1、 間接ELISA檢測抗血清效價姓名：王賢臣 學號：1125400080（成都醫學院 醫學檢驗 成都610500）【摘要】目的：通過實驗掌握間接酶聯免疫吸附測定技術（ELISA）的原理及操作過程及間接ELISA檢測抗血清效價的實驗條件優化及效價的確定。方法：間接ELISA雙抗體夾心法對包被抗原及酶標抗體工作濃度進行探索。結果：經過預實驗初步確定抗人白蛋白血清包被濃度和一二抗的濃度，然后在正式實驗確定其濃度，從而再進行研究。討論：間接ELISA檢測抗血清效價的影響因素。并將預實驗方法的結果與確定實驗的結果進行對比，和分析在實驗過程中的注意事項。【關鍵詞】抗人白蛋白ABL ELISA 前言：1971

2、年Engvall和Perlmann 發表了酶聯免疫吸附測定用于IgG 定量測 定的文章，使得1966年開始用于抗原定位的酶標抗體技術發展為體液標本中微量物質的測定方法。之一方法的基本原理是：使抗原或抗體結合到某種固相載體表面，并保持器免疫活性。使抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體，這種酶標抗原后抗體即保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測定時，把受檢標本（測定其中的抗體或抗原）和酶標抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與其他物質分開，最后結合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質的量成一定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催化變為

3、有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據顏色反應的深淺定性或定量分析。由于酶的催化頻率很高，故可極大的放大反應效果，從而使測定方法達到很高的敏感度。實驗方法： 預實驗設計方案： 1、材料與方法 1.1儀器：洗板機（BIO-RAD MODEL 1575 ） SM自動化酶免疫分析儀（北京天石醫療用品制作所 BIO-RAD 680） 電熱恒溫箱（上海恒科技儀器有限公司） 移液槍（上海求精生化試劑儀器有限公司） 微孔反應板 刻度吸管 （5ml、1ml） 吸耳球 試管架 塑料試管 封口紙 燒杯 1.2試劑：人ALB標準品（SIGMA :A1653 SIZE:250MG storage:2

4、-8） PBS緩沖液：0.1M pH7.4(PBS 1L配方pH7.4：磷酸二氫鉀(KH2PO4)0.2g，十二水水磷酸氫二鈉(Na2HPO4.12H2O)3.58g，氯化鈉(NaCl)8.0g，氯化鉀(KCl)0.2g，加水至1000mL) 包被液：0.05M pH9.6碳酸鹽緩沖液 洗滌液：0.05%Tween-PBS(即PBST) (0.05%Tween-PBS 1000mlPBS加500ul吐溫） 封閉液：1%干酪素-PBST（1%酪蛋白溶液 100mlPBS加1g干酪素） 顯色液（A液、B液Cat:ME002 可溶性TMB顯色液) 終止液：2M H2SO4 酶標抗體（兔抗羊-HRP，

5、武漢博士德生物工程有限公司） 1.3待測標本：羊抗人ALB（效價1:70 批號：201106 貯存于4-20，有效期：2年） 1.4方法： 預實驗 包被抗原(100ul/孔) 4過夜或372h 洗滌3次 拍干 加封閉液(300ul/孔) 4過夜或372h 洗滌3次 拍干 加入標本(100ul/孔) 371h 洗滌5次 拍干 加入酶標抗體(100ul/孔) 拍干 371h 洗滌5次 加入顯色劑A、B液各50ul/孔 3715-20min 加入終止液(100ul/孔) 檢測表1：包被抗體和酶標記抗體棋盤滴定羊抗人ALB血清羊抗人ALB血清兔抗羊IgG-HRP1:101:401:1601:6401:

6、2560PBS兔抗羊IgG-HRP1:101：401：1601：6401：2560PBS1:500人ALB：10ug/ml1:500人ALB：1ug/ml1:20001:20001:80001:80001:160001:16000羊抗人ALB血清羊抗人ALB血清兔抗羊IgG-HRP1:101:401:1601:6401:2560PBS兔抗羊IgG-HRP1:101：401：1601：6401：2560PBS1:500人ALB：0.1ug/ml1:500人ALB 0.01ug/ml1:20001:20001:80001:80001：160001:16000（1） 將人ALB用包被液稀釋為： 0.

7、01ug/ml 0.1ug/ml 1ug/ml 10ug/ml（2）酶標結合物（兔抗羊IgG-HRP）稀釋為： 1:500 1:2000 1:8000 1:16000（3）抗人白蛋白血清（羊抗人ALB血清）稀釋為： 1:10 1:40 1:160 1:640 1:2560 在初步結果的基礎上繼續細化工作濃度，重新檢測以確定最終最適包被抗原和酶標抗體的最終工作濃度，即建立間接ELISA法檢測抗人白蛋白血效價。 正式 包被抗原(100ul/孔) 4過夜或372h 洗滌3次 拍干 加封閉液(300ul/孔) 4過夜或372h 洗滌3次 拍干 加入標本(100ul/孔) 371h 洗滌5次 拍干 加入

8、酶標抗體(100ul/孔) 拍干 371h 洗滌5次 加入顯色劑A、B液各50ul/孔 3715-20min 加入終止液(100ul/孔) 檢測表2：包被抗體和酶標記抗體棋盤滴定包被抗原的濃度為0.1ug /ml 0.01 ug /ml，每個濃度做三排，共做六排，測出OD值羊抗人ALB血清兔抗羊IgG-HRP1:101:401:1601:6401:25601:102401:40960PBS1:8000人ALB：0.1ug/ml1:100001:16000羊抗人ALB血清兔抗羊IgG-HRP1:101:401:1601:6401:25601:102401:40960PBS1:8000人ALB：0

9、.01ug/ml1:100001:16000 2、結果 預實驗：表3：我們組預實驗結果確定最適抗原濃度 取每個區域中二抗濃度同一行的五個數據進行分析，共得出20張線性關系圖，取R值最大且稀釋比例最大的區域為最適抗原濃度確定二抗濃度 在確定包被抗原濃度后取該區域中二抗濃度同一行的五個數據進行分析共得出4張線性關系圖，取R值最大OD值最大不超過2且稀釋比例最大的區域為最適二抗濃度注：1、系列1、2、3、4分別為兔抗羊IgG-HRP 1:500、1:2000、1:8000、1:16000稀釋與不同羊抗人血清稀釋濃度（1:10、1：40、1：160、1：640、1：2560）對應所得的吸光度圖像2、X

10、軸1、2、3、4、5分別對應羊抗人血清稀釋濃度1:10、1：40、1：160、1：640、1：2560由上述四圖得：包被抗原濃度在10 ug/ml 1 ug/ml 0.1 ug/ml時數據跳動大對結果意義不大。而包被抗原濃度在0.1ug/ml時跳動稍小。因此的包被抗原濃度在0.11ug/ml 二抗濃度在1/80001/16000最適。 正式：表4：我們組正式實驗結果跳動很大不成線性關系無分析意義我們以第四組的正式實驗結果進行分析注：H、G、F、E、D、C、B、A分別對應羊抗人ALB血清稀釋濃度1:10、1:40、1:160、1:640、1:2560、1:10240、1:40960、PBS1、2

11、、3、4、5、6分別對應兔抗羊IgG-HRP稀釋濃度1:8000、1:10000、1:16000、1:8000、1:10000、1:16000將人ALB：0.1ug/ml 0.01ug/ml條件下兔抗羊IgG-HRP稀釋濃度1:8000、1:10000、1:16000、1:8000、1:10000、1:16000同一行的7個數據進行分析，共得出6張線性關系圖，取OD值最大不超過2且吸光度隨稀釋倍數的增加呈線性變化的曲線所對應的數值作為正式實驗結果分析的依據得出效價注：系列1、2、3分別對應兔抗羊IgG-HRP稀釋濃度1:8000、1:10000、1:16000X軸1、2、3、4、5、6、7分別

12、對應羊抗人血清稀釋濃度1:10、1:40、1:160、1:640、1:2560、1:10240、1:40960取OD值最大不超過2且吸光度隨稀釋倍數的增加呈線性變化的曲線所對應的數值作為正式實驗結果分析的依據得出效價由上兩圖六張曲線的對比在人ALB: 0.1ug/ml兔抗羊IgG-HRP稀釋濃度1:8000條件下吸光度隨稀釋倍數的增加呈線性變化最為明顯，所以本次實驗應以該組實驗數據來計算抗血清效價。1:101:401:1601:6401:25601:102401:40960陰性對照1.711.3311.0461.0630.6840.7020.4510.798COV=0.1 + OD陰性對照CO

13、V=0.1+0.798=0.898陽性：OD樣品COV 陰性：OD樣品COV 所以抗血清效價為1：6403、討論 在本次實驗中我們組順利測出預實驗結果數據，正式實驗未能準確的測量到位，可能原因有在實驗加樣過程中，溶液加樣量不均；當再加入顯色液A、顯色液B時在孵育過程中對于顏色變化沒有掌握好從而導致顏色過深無法檢測其吸光度；在加二抗孵育結束后再洗完板后由于時間關系必須得等幾天才能繼續試驗，但在保存過程中沒有將板拍干，從而會使結果偏差；在實驗時，拍板未能拍干； 同時在用間接酶聯免疫吸附測定技術ELISA的雙抗體夾心法測定抗血清效價中影響實驗結果的因素有：(1) 實驗是由多個人進行操作個人手法不一樣

14、很容易引起誤差；（2）包被抗原時,因為試劑沒有配夠，整塊板子的抗原前后配制了3次，濃度誤差大大增加，對結果造成影響；（3）加入封閉液后放入冰箱內隔了好幾天才拿出來進行洗板，拿出來時看到板子的底部有很多白色的沉淀物，很有可能是滋生了很多雜菌，污染了抗原；（4）第一次預實驗的封閉過程進行了三天，極有可能是造成背景過高的首要原因；（5）加入顯色液后看到顯色梯度但是沒有立即加入終止液導致測量結果沒有出現理想值。而且大家由于操作不熟練加液速度非常慢，也可能影響顯色進而影響結果；（6）在加一抗和二抗時用手指放在反應板上，手上很多雜質比如蛋白質，汗液污染了板，繼而影響了板底得抗原或者一抗二抗等物質。4、結論 在本次實驗中我們組順利測出預實驗結果數據，正式實驗未能準確的測量到位。根據數據得出包被抗原最適濃度在0.01ug/ml-0.1ug/ml ，二抗最適比例在1：8000及1：16000 。在正式實驗時數據跳動大沒有多大的實際參考價值。但測得第四組的結果效價為1：640 參考文獻：1李宏杰，方磊，程家坤，祖華.ELISA(雙抗體夾心法)共系統檢測抗-HBe與HBeAg結果分析.J中國現代醫生，2007.102呂世靜.臨床免疫學檢驗第二版.北京.中國醫藥科技出版社,2010:92-933葉應嫵，王毓三，申子瑜.全國臨床檢驗操作規