1、肺炎鏈球菌蛋白質(zhì)疫苗研究進(jìn)展駱詩(shī)露，黃健，韓道賓，朱杰華,陳澤慧，閔迅（遵義醫(yī)學(xué)院，貴州遵義563003）摘要:隨著肺炎疑球菌（SP）耐藥菌株的不斷出現(xiàn)使得疫苗研發(fā)備受關(guān)注,但目前使用的莢膜多糖及其結(jié)合疫苗有很大局限性。因此，針對(duì)SP主要毒力因子的蛋白質(zhì)疫苗迅速發(fā)展，其中SP單一蛋白質(zhì)疫苗包括溶血素、表面蛋白A、表面黏附素A、三組氨酸蛋白D、黏附毒力因子A,蛋白質(zhì)聯(lián)合疫苗包括多價(jià)重組蛋白質(zhì)聯(lián)合疫苗、多價(jià)蛋白質(zhì)融合疫苗，已取得一定實(shí)驗(yàn)和臨床效果,有望替代多糖疫苗。關(guān)鍵詞:肺炎鏈球菌;重組蛋白;聯(lián)合疫苗;融合疫苗doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.10.046中圖分

2、類號(hào):R378.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1002-266X（2016）10-0102-03肺炎鏈球菌（SP）是一種重要的人類致病菌，主要引起細(xì)菌性肺炎、中耳炎、腦膜炎等疾病,2歲以下嬰幼兒和60歲以上老年人是其最主要的易感人群。隨著耐藥菌抹的不斷出現(xiàn)，通過(guò)接種疫苗已成為預(yù)防SP感染行之有效的手段。目前,市售的SP疫苗均基于其血清特異性莢膜多糖（CPS）設(shè)計(jì)，主要有多糖疫苗（PPV）、多糖結(jié)合疫苗（PCV）。PPV免疫原性較弱，對(duì)SP主要易感人群的保護(hù)性較差，對(duì)成人SP肺炎以及支氣管炎的作用很弱甚至沒(méi)有作用;PCV雖能有效保護(hù)主要易感人群，但存在覆蓋面窄（僅為歐美國(guó)家的常見(jiàn)血清型）、制備成本較

3、高、使用過(guò)程中存在莢膜血清型轉(zhuǎn)換等缺點(diǎn),嚴(yán)重限制了其在發(fā)展中國(guó)家的使用。因此,蛋白質(zhì)疫苗已成為近十年SP疫苗的研發(fā)主流。本文就SP單一蛋白質(zhì)疫苗及其聯(lián)合、融合蛋白疫苗的研究進(jìn)展綜述如下。1SP單一蛋白質(zhì)疫苗1.1SP溶血素（Ply）Ply是一種膽固醇依賴的造孔毒素，其具有直接的細(xì)胞毒性作用,能與宿主上皮細(xì)胞表面的膽固醇結(jié)合并插入到脂質(zhì)雙分子層中以形成寡聚孔，能引起細(xì)胞溶解并促進(jìn)細(xì)菌擴(kuò)散；此外,Ply還能通過(guò)與Gq、Fc段及CRP結(jié)合以激活補(bǔ)體經(jīng)典途徑，也能誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子IL-1。,從而參與宿主的炎性反應(yīng)。因Ply在低濃度作用時(shí)的促炎效應(yīng)可導(dǎo)致嚴(yán)重的肺損傷及細(xì)胞凋亡，所以當(dāng)前運(yùn)用

4、的疫苗主要是經(jīng)過(guò)化學(xué)減毒或無(wú)毒化處理后的衍生物，如第433位苯丙氨酸替換色基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81460317）；貴州省聯(lián)合基金項(xiàng)目（黔科合LH字20147553號(hào)）。通信作者：閔迅（E-mail：2815400619.com）氨酸的PdB及第146位丙氨酸缺失的AA146PlyoKnippenberg等"以PdB主動(dòng)免疫小鼠后，可以阻斷Ply介導(dǎo)的肺纖維化效應(yīng)。在構(gòu)建的小鼠鼻黏膜免疫模型中,AA】46Ply能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生有效的細(xì)胞免疫及體液免疫應(yīng)答，可抵抗不同型別SP引起的致死性感染。此外，PlyDl無(wú)毒衍生物已經(jīng)進(jìn)入I期安全性及人體免疫原性試驗(yàn).證實(shí)成人經(jīng)免疫后能

5、產(chǎn)生大量的抗PlyDl的保護(hù)性抗體。1.2 SP表面蛋白A（PspA）PspA是SP表面的膽堿結(jié)合蛋白，也是一種重要毒力因子。目前，已在其N(xiāo)端和脯氨酸富集區(qū)發(fā)現(xiàn)有B細(xì)胞抗原表位的存在。在小鼠系統(tǒng)性感染模型中，PspA可于擾C3b在SP表面沉積，阻止補(bǔ)體介導(dǎo)的調(diào)理吞噬作用;并旦在小鼠黏膜感染模型中，能夠保護(hù)SP免遭宿主乳鐵蛋白的攻擊3。此外,Roche等構(gòu)建的Balb/c小鼠敗血癥模型中，經(jīng)皮下或腹腔途徑免疫全長(zhǎng)的PspA,可以顯著提高小鼠的生存時(shí)間及生存率。Arulanandam等”構(gòu)建的小鼠鼻咽定植模型證實(shí)，經(jīng)鼻腔滴注全長(zhǎng)的PsaA與IL-12可減少75%的鼻咽部SP定植量。在小鼠中耳炎模型

6、中，PspA抗體同樣能夠提供有效的保護(hù)。1.3 SP表面黏附素A（PsaA）PsaA是一種分子量為37kD的多功能脂蛋白，其在不同的血清型SP中具有較高的保守性，主要參與SP對(duì)Mn2Zn24的轉(zhuǎn)運(yùn)及對(duì)宿主上皮細(xì)胞的黏附效應(yīng)。有研究證實(shí)，與野生型TIGR4菌株相比,PsaA缺陷菌株能顯著降低其對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的黏附能力及其對(duì)CBA/N小鼠的系統(tǒng)性感染能力cPsaA與CT佐劑聯(lián)合經(jīng)鼻咽部免疫小鼠后，可誘導(dǎo)其產(chǎn)生高滴度黏膜抗體IgA;而口服微粒體包裹的PsaA蛋白，血清中可產(chǎn)生高滴度的IgG和IgA抗體,從而抵抗不同血清型SP在肺部定植及敗血癥的形成。Oliveira等將PsaA與乳酸桿菌活菌載體共同經(jīng)

7、鼻腔免疫C57BL/6小鼠后,能夠同時(shí)誘導(dǎo)PsaA特異性的系統(tǒng)免疫抗體IgG和黏膜免疫抗體IgA的產(chǎn)生，從而抑制SP在鼻咽部定植。1.4 SP三組氨酸蛋白D(PhtD)PhtD是Pht家族中最保守的蛋白，能夠介導(dǎo)SP黏附宿主呼吸道上皮細(xì)胞及參與調(diào)節(jié)Zr?的動(dòng)態(tài)平衡;幫助逃避補(bǔ)體的免疫沉積，激發(fā)小鼠體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答*。在OF1雌性小鼠鼻咽部致死性攻擊模型中，經(jīng)肌肉接種PhtD蛋白后，能對(duì)不同血清型SP的致死性攻擊產(chǎn)生很好的保護(hù)效果，且健康人體內(nèi)獲得的抗PhtD血清也能給小鼠敗血癥模型中提供較高的被動(dòng)保護(hù)效果E】。此外，恒河猴經(jīng)肌肉接種PhtD蛋白后，能顯著提高其對(duì)19F型SP所致肺炎的抵抗

8、力。針對(duì)PhtD重組蛋白疫苗的I期臨床試驗(yàn)證實(shí),健康成人免疫接種該蛋白后，能產(chǎn)生很好的體液免疫效果，且未產(chǎn)生明顯的不良反應(yīng)3)。與傳統(tǒng)的鋁佐劑相比,PhtD與新型佐劑AS02V聯(lián)合使用后，能顯著促進(jìn)PhtD觸發(fā)的體內(nèi)CD4T細(xì)胞及記憶性B細(xì)胞的產(chǎn)生,從而提升對(duì)老年人的免疫保護(hù)效果3)。因此,PhtD成為當(dāng)前單個(gè)疫苗或聯(lián)合疫苗的首選。1.5 SP黏附毒力因子A(PavA)PavA為SP細(xì)胞壁外層的一種纖維連接蛋白結(jié)合蛋白，在細(xì)菌早期黏附及侵襲過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。與D39APavA缺陷菌株相比，野生型菌株能逃避人樹(shù)突狀細(xì)胞的吞噬及機(jī)體的固有免疫應(yīng)答址。在構(gòu)建的腦膜炎模型中,D39APavA菌株感染

9、小鼠的毒力明顯下降,且黏附A549.Hep-2細(xì)胞、人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的能力也受到了明顯的抑制。2SP蛋白質(zhì)聯(lián)合疫苗目前，尚未見(jiàn)單一SP蛋白質(zhì)疫苗保護(hù)作用強(qiáng)于PPV23的報(bào)道。因此,研究者將不同毒力因子進(jìn)行組合以制備SP蛋白質(zhì)聯(lián)合疫苗，且蛋白間的共同作用可能起互補(bǔ)效應(yīng)。文獻(xiàn)報(bào)道，重組PhtD及PspA聯(lián)合疫苗即將啟動(dòng)II期臨床。2.1多價(jià)重組蛋白質(zhì)聯(lián)合疫苗Briles等"9】將混合后的PspA.PsaA經(jīng)鼻腔免疫小鼠，比二者單獨(dú)免疫更能有效阻止SP在鼻咽部的定植。在19F所致的肺炎模型中，證實(shí)PspA和Ply聯(lián)合免疫能有效抵抗菌血癥甚至是敗血癥(狽。Ogunniyi

10、等幻：研究發(fā)現(xiàn),與單個(gè)蛋白免疫相比，將PdB、PspA、PspC等兩兩組合，能顯著提高不同血清型SP侵襲性感染小鼠的中位生存率，且3種蛋白聯(lián)合主動(dòng)免疫小鼠能使保護(hù)效果達(dá)到最佳。在近期的臨床對(duì)照研究中，SP膽堿結(jié)合蛋白A(PcpA)+PhtD+PlyDl三者聯(lián)合疫苗主動(dòng)免疫不同年齡階段人群，顯示出較高的安全性及免疫原性'勺。但是，也有3種蛋白抗原聯(lián)合的保護(hù)作用不及兩兩聯(lián)合者的報(bào)道，可能為聯(lián)合免疫存在拮抗效應(yīng)所致。因此，仍需繼續(xù)臨床前嘗試,力爭(zhēng)找出最優(yōu)化的多價(jià)重組蛋白質(zhì)聯(lián)合疫苗。2.2多價(jià)蛋白質(zhì)融合疫苗融合蛋白是一種將表達(dá)不同蛋白的功能活性域聯(lián)合協(xié)同作用使融合蛋白性能被優(yōu)化，甚至產(chǎn)生新的生

11、物學(xué)活性的新技術(shù)。Lu等心以PsaA-PspA融合蛋白免疫小鼠后，可以誘導(dǎo)其產(chǎn)生大量抗PsaA.PspA抗體，該抗體可以與表達(dá)異源PspA的不同血清型SP結(jié)合;在鼻咽部攻擊模型中,與無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(PBS)相比,經(jīng)融合蛋白免疫的小鼠可顯著減少其血及肺部定植的細(xì)菌最。融合蛋白PsaA-SP溶血素?zé)o毒衍生物(PdT)與SP細(xì)胞壁肽聚糖混合后經(jīng)鼻腔或皮下免疫小鼠，能引起血清中高滴度抗體和IL-17A的產(chǎn)生，并能在高毒力3型SP攻擊模型中提供保護(hù)3】。在Liu等研究中首次證實(shí)了AA146Ply具有黏膜佐劑的功能，SP熱休克蛋&(DnaJ)-AA146Ply融合蛋白表達(dá)后通過(guò)黏膜途徑能誘導(dǎo)C5

12、7BL/6小鼠產(chǎn)生較高水平的特異性抗體IgG和slgA,能有效幫助小鼠抵抗SP在鼻咽部、肺部定植及致死性感染。而SP膽堿結(jié)合蛋白A(CbpA)活性肽與Ply類毒索U60D融合后，其保護(hù)效力更為強(qiáng)大,其誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體除了能夠抵抗SP引起的各種侵襲性疾病(IPD)外，還具有潛在的抵抗其他引起腦膜疾病的病原菌的能力。新近研究顯示,AA146Ply基因與PsaA融合后，能促進(jìn)兒童黏膜免疫系統(tǒng)中Thl/Thl7細(xì)胞增殖，有助于抗SP的CD4T細(xì)胞免疫活性的發(fā)揮。融合蛋白是種安全有效的新型疫苗，但在融合蛋白的構(gòu)建過(guò)程中難免會(huì)影響或破壞蛋白質(zhì)原有的結(jié)構(gòu)，從而影響其活性的發(fā)揮。因此,在進(jìn)行蛋白融合時(shí)應(yīng)選擇合理

13、的方式，使兩種蛋白質(zhì)的效應(yīng)均得到最大程度發(fā)揮。目前,PPV和PCV疫苗的保護(hù)效果僅覆蓋部分SP血清型別，且存在血清型替換等諸多問(wèn)題。因此，研發(fā)新型蛋白質(zhì)疫苗迫在眉睫。當(dāng)前，研究者多選擇與SP致病過(guò)程密切相關(guān)的的多價(jià)蛋白質(zhì)聯(lián)合或者蛋白融合疫苗為研究對(duì)象，以觀察其對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是否具有顯著的保護(hù)效應(yīng)。迄今為止，尚無(wú)FDA批準(zhǔn)的SP蛋白質(zhì)疫苗上市，但隨著相關(guān)研究的不斷深入，多價(jià)SP蛋白質(zhì)疫苗必將造福于人類。參考文獻(xiàn)：1KnippenbergS,UeberbergB,MausR,etal.StreptococcuspneumoniaetnggerBprogressionofpulmonaryfibrosi

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