1、覆盆子鑒別與含量測定方法學確認方案文件審批部 門姓 名簽名日期起 草 人質量部XXX年月日審 核 人質量部XXX年月日批 準 人質量部XXX年月日專業資料1、目的本試驗對覆盆子鑒別與含量測定檢驗方法進行確認，為了確保檢驗數據的科學性、準確性和可靠性， 制定本確認方案， 以確定建立的鑒別與含量測定檢驗方法能夠對該產品進行準確的檢驗，為我司化驗室以后的覆盆子檢驗方法提供依據。2、范圍本方案適用于我公司覆盆子鑒別與含量測定檢驗方法的確認。3、職責職務崗位姓名職責1.確認方案及報告的審核；確保方案及報告內容符合質量部部GMP 及檢測要求。組長XXX2.組織實施確認工作， 確保確認工作嚴格按照方案實施；

2、長3.確認過程中偏差和變更的審核，組織確認過程中發生的偏差的調查；小組QC 主任XXX負責確認方案及確認報告的起草，確認實施記錄的審核成員QCXXX按照確認方案進行確認工作，填寫記錄，并判定是否符合認可標準要求4、確認依據文件中國藥典 2015 年版5、確認程序5.1 先決條件的確認儀器經過校準確認所需儀器經過校準并在有效期內，確認記錄見附表01。人員培訓確認確認小組人員參加了本方案的培訓，以及儀器的操作、 維護和保養培訓、 偏差處理、變更控制等SOP 的培訓，確認記錄見附表02。相關 SOP 的確認制定儀器操作、校驗、維護和保養標準程序并批準，確認記錄見附表03。藥品的確認確認方案確認過程中

3、使用的藥品符合規定，并在有效期內。確認記錄見附表04。5.2 鑒別方法學確認專屬性：專業資料供試品溶液制備取山柰酸 -3-O- 蕓香糖苷含量測定項下供試品溶液，即得。對照品溶液制備取椴樹苷對照品， 加甲醇制成每 1ml 含 0.1mg 的溶液，即得。陰性溶液制備照供試品溶液制備方法除取樣品外，同法制成陰性溶液。測定照薄層色譜法標準操作規程試驗，吸取上述供試品溶液與陰性溶液各5 l ，及對照品溶液2 l ，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以乙酸乙酯 -甲醇 -水 -甲酸（90 440.5 ）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以三氯化鋁溶液，在105 加熱 5 分鐘，在紫外光燈（ 365nm ）下檢視。

4、供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點；陰性液在相應位置上不顯斑點（見薄層色譜圖05-1 ）。確認記錄見附表05。5.3 含量測定方法學確認鞣花酸含量測定檢查方法：照高效液相色譜法標準操作規程測定。色譜條件與系統適用性試驗以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-0.2%磷酸溶液（ 15 85 ）為流動相；檢測波長為 254nm 。理論板數按鞣花酸峰計算應不低于 3000 。對照品溶液的制備取鞣花酸對照品適量，精密稱定，加70%甲醇制成每 1ml含 5g 的溶液，即得。供試品溶液的制備取本品粉末（過四號篩）約0.5g ，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇 50m

5、l ，稱定重量，加熱回流1 小時，放冷，再稱定重量，用 70%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續濾液1ml ，置 5ml 量瓶中，用 70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 l ，注入液相色譜儀，測定，即得。本品按干燥品計算，含鞣花酸（C 14H6O 8 ）不得少于 0.20%。系統適用性確認色譜條件高效液相色譜儀XXXXX色譜柱Aglilent TC-C18(2)250*4.6mm5um流速1.0ml/min檢測波長254nm ，UV 檢測器專業資料柱溫25 進樣量10 l運行時間30min5.3.1.2.2 溶液配制名稱配制

6、方法分別量取乙腈（色譜純）與超純水，以乙腈 -0.2%磷酸溶液（15 流動相85 ）的比例混合，用 0.45 m水系微孔濾膜濾過，超聲脫氣 10min ，即得。必要時可根據實際使用情況調整配制溶液的體積。空白溶劑樣品處理用 70%甲醇溶液。取鞣花酸對照品適量，精密稱定，加 70%甲醇制成每 1ml 含 5g對照品溶液的溶液，即得。平行制備 2 份，分別為對照品溶液1、2。取本品粉末（過四號篩） 約 0.5g ，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入 70%甲醇 50ml ，稱定重量，加熱回流 1 小時，放冷，供試品溶液再稱定重量，用 70%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續濾液 1ml ，

7、置 5ml 量瓶中，用 70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。平行制備 2 份，分別為供試品溶液1、2。5.3.1.2.3 試驗操作待儀器穩定后， 按下列進樣序列注入高效液相色譜儀， 記錄色譜圖， 以鞣花酸峰面積計算 5 針對照品溶液 1 的 RSD；按外標法以對照品溶液 1 的鞣花酸峰面積計算對照品溶液 2 的回收率。序號樣品名稱進樣體積（ ul ）進樣針數1空白溶劑512對照品溶液 1553對照品溶液 252系統適用性回收率按以下公式計算對照品溶液2 的回收率：專業資料RcR21AR21 M R1CR1 100%Rc R22AR22M R1C R1100%AR1 M R2CR2

8、AR1M R2CR2式中：A R1 、A R21、A R22 ：分別為對照品溶液1 連續 5 針的平均峰面積和對照品溶液 2 第一針和第二針的峰面積；M R1、 M R2：分別為對照品1、2 的稱樣量；C R1 和 C R2：分別為對照品1、 2 中鞣花酸的含量；Rc R21 和 Rc R22：分別為對照品溶液2 第 1 針和第 2 針的回收率；可接受標準5 針對照品溶液 1 鞣花酸主峰的保留時間的 RSD 均不大于 2.0%，鞣花酸主峰面積的 RSD均應不大于 1.0%；對照品溶液 2 的回收率應在 98.0% 102.0% 。理論板數按鞣花酸峰計算應不低于 3000。注：若系統適用性不符合

9、標準應立即停止進樣，排查原因后再重做系統適用性，系統適用性合格后方可進行如下試驗。確認記錄見附表06。5.3.1.3 含量測定5.3.1.3.1 操作系統適用性合格后，接著系統適用性進樣序列取供試品溶液1、2，用 0.45um（尼龍 66）一次性針式過濾頭棄去 5ml 后取續濾液，進樣，進樣序列如下（序號4、5、6）：序號樣品名稱進樣體積（ ul）進樣針數1空白溶劑512對照品溶液 1553對照品溶液 2524供試品溶液 1525供試品溶液 2526對照品溶液 152注：在對照品溶液1 運行完成后一般間隔10 針（以時間最短的計）后，應重新插入 2 針對照品溶液1，作為系統跟蹤，以此來評價系統

10、穩定性。計算專業資料綜合前面 5 針對照品溶液 1 和后面 2 針對照品溶液 1 計算鞣花酸峰面積的RSD，當 RSD 不大于 2.0%時，按以下公式計算覆盆子的含量：供試品峰面積/ 對照品峰面積對照品濃度含量 %100%供試品重量（1水分 %） 稀釋倍數注：綜合供試品溶液的前面 5 針對照品溶液 1 和后面 2 針對照品溶液 1 計算鞣花酸峰面積的 RSD不符合規定時，應排查原因后，再按項重新測定。可接受標準：按干燥品計算，含鞣花酸（C 14H6O 8 ）不得少于 0.20%。確認記錄見附表06 。山柰酸 -3-O- 蕓香糖苷含量測定檢查方法：照高效液相色譜法標準操作規程測定。色譜條件與系統

11、適用性試驗以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-0.2%磷酸溶液（15 85）為流動相；檢測波長為 344nm 。理論板數按山柰酸 -3-O- 蕓香糖苷峰計算應不低于 3000。對照品溶液的制備取山柰酸 -3-O- 蕓香糖苷對照品適量，精密稱定，加70%甲醇分別制成每1ml 含 80 g 的溶液，即得。供試品溶液的制備取本品粉末（過四號篩）約1g ，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入 70%甲醇 50ml ，稱定重量，加熱回流提取1 小時，放冷，再稱定重量，用 70%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續濾液25ml ，蒸干，殘渣加水20ml 使溶解，用石油醚振搖提取3 次，每次 20m

12、l ，棄去石油醚液，再用水飽和正丁醇振搖提取 3 次，每次 20ml ，合并正丁醇液，蒸干，殘渣加甲醇適量使溶解，轉移至 5ml 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 l ，注入液相色譜儀，測定，即得。本品按干燥品計算，含山柰酸-3-O- 蕓香糖苷（ C 27H30 O 15 ）不得少于 0.03% 。系統適用性確認色譜條件高效液相色譜儀XXX色譜柱Aglilent TC-C18(2)250*4.6mm5um流速1.0ml/min檢測波長344nm ，UV 檢測器專業資料柱溫25 進樣量10 l運行時間35min溶液配制名稱配制方法分

13、別量取乙腈（色譜純）與超純水，以乙腈 -0.2%磷酸溶液（15 流動相85 ）的比例混合，用0.45 m水系微孔濾膜濾過，超聲脫氣10min ，即得。必要時可根據實際使用情況調整配制溶液的體積。空白溶劑樣品處理用 70%甲醇溶液。取山柰酸 -3-O- 蕓香糖苷對照品適量，精密稱定，加70%甲醇對照品溶液分別制成每 1ml 含 80 g 的溶液，即得。平行制備 2 份，分別為對照品溶液1、2。取本品粉末（過四號篩）約1g ，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入 70%甲醇 50ml ，稱定重量，加熱回流提取 1 小時，放冷，再稱定重量，用 70%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續濾液 25

14、ml ，蒸干，殘渣加水 20ml 使溶解，用石油醚振供試品溶液搖提取 3 次，每次 20ml ，棄去石油醚液，再用水飽和正丁醇振搖提取 3 次，每次 20ml ，合并正丁醇液，蒸干，殘渣加甲醇適量使溶解，轉移至 5ml 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。平行制備 2 份，分別為供試品溶液1、2。試驗操作待儀器穩定后，按下列進樣序列注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，以山柰酸-3-O- 蕓香糖苷峰面積計算5 針對照品溶液 1 的 RSD；按外標法以對照品溶液1 的山柰酸 -3-O- 蕓香糖苷峰面積計算對照品溶液2 的回收率。序號樣品名稱進樣體積（ ul ）進樣針數1空白溶劑512對照

15、品溶液 1553對照品溶液 252專業資料系統適用性回收率按以下公式計算對照品溶液2 的回收率：RcR21AR21M R1CR1 100%Rc R22AR22M R1C R1100%AR1 M R2CR2AR1M R2CR2式中： A R1 、A R21、A R22 ：分別為對照品溶液 1 連續 5 針的平均峰面積和對照品溶液 2 第一針和第二針的峰面積；M R1、 M R2：分別為對照品1、2 的稱樣量；C R1 和 C R2：分別為對照品1、 2 中山柰酸 -3-O- 蕓香糖苷的含量；Rc R21 和 Rc R22：分別為對照品溶液2 第 1 針和第 2 針的回收率；可接受標準5 針對照品

16、溶液 1 山柰酸 -3-O- 蕓香糖苷主峰的保留時間的RSD 均不大于 2.0%，山柰酸 -3-O- 蕓香糖苷主峰面積的RSD 均應不大于 1.0%；對照品溶液2 的回收率應在 98.0%102.0% 。理論板數按山柰酸 -3-O- 蕓香糖苷峰計算應不低于 3000 。注：若系統適用性不符合標準應立即停止進樣， 排查原因后再重做系統適用性， 系統適用性合格后方可進行如下試驗。確認記錄見附表 07。5.3.2.3 含量測定5.3.2.3.1 操作系統適用性合格后，接著系統適用性進樣序列取供試品溶液1、2，用 0.45um（尼龍 66）一次性針式過濾頭棄去 5ml 后取續濾液，進樣，進樣序列如下（

17、序號4、5、6）：序號樣品名稱進樣體積（ ul）進樣針數1空白溶劑512對照品溶液 1553對照品溶液 2524供試品溶液 1525供試品溶液 252專業資料6對照品溶液 152注：在對照品溶液1 運行完成后一般間隔10 針（以時間最短的計）后，應重新插入 2 針對照品溶液1，作為系統跟蹤，以此來評價系統穩定性。計算綜合前面 5 針對照品溶液 1 和后面 2 針對照品溶液 1 計算山柰酸 -3-O- 蕓香糖苷峰面積的 RSD，當 RSD 不大于 2.0%時，按以下公式計算覆盆子的含量：供試品峰面積/ 對照品峰面積對照品濃度含量 %100%供試品重量（1水分 %） 稀釋倍數注：綜合供試品溶液的前

18、面5 針對照品溶液 1 和后面 2 針對照品溶液 1 計算山柰酸-3-O- 蕓香糖苷峰面積的 RSD 不符合規定時，應排查原因后，再按項重新測定。可接受標準：按干燥品計算，含山柰酸-3-O- 蕓香糖苷（ C 27H30O 15）不得少于 0.03% 。確認記錄見附表 07。6、偏差處理在確認過程中， 應嚴格按照確認方案進行操作和判定，出現個別指標不符合標準的結果時，針對不合格指標應展開調查分析， 對于確認是因操作不當等自身原因造成，應重新進行測試。確認過程中所產生的偏差記錄在附表08 中。7、變更控制涉及到方案變更時，填寫“變更申請表” ，需要對其進行原因分析，根據分析結果決定是否需要重新制定

19、確認方案還是修改可接受標準， 并將涉及到的變更情況記錄在附表 09 中。8、附表清單編號附表名稱編號附表名稱01儀器校驗確認記錄表06鞣花酸含量測定方法確認記錄表02人員培訓確認記錄表07山柰酸 -3-O- 蕓香糖苷含量測定方法確認記錄表03相關 SOP 確認記錄表08偏差處理確認記錄04藥品確認記錄09變更控制確認記錄5 鑒別方法確認記錄表專業資料9、變更記錄版本號批準日期變更描述00/新文件。附表 01：儀器校驗確認記錄表儀器校驗確認儀器名稱型號檢定有效期至檢定證書編號符合要求電子天平XXX是 否XXX是 否高效液相色譜儀XXX是 否玻璃儀器校驗確認玻璃儀器名稱規程編號校正日期符合要求10

20、ml是 否容量瓶25ml是 否50ml是 否100ml是 否是 否是 否移液管10ml是 否50ml是 否是否存在偏差或不一致項：是偏差或不一致記錄在偏差報告中，偏差編號：。否結論：所有儀器均經校驗且在有效期內。專業資料檢查人 / 日期復核人 / 日期附表 02：人員培訓確認記錄表XXX 電子天平XXX 型高效液覆盆子鑒別與偏差處理變更控制相色譜儀標準培訓記錄含量測定方法標準操作與維標準管理標準管理操作與維護規學確認方案護規程規程規程程培訓時間培訓地點課時講師姓名是否已接受培訓（是用“”表示，否用“”表示）是否存在偏差或不一致項：是偏差或不一致記錄在偏差報告中，偏差編號：。否結論：執行本方案的

21、人員已得到必要的培訓。檢查人 / 日期復核人 / 日期專業資料附表 03：相關 SOP 確認記錄表SOP 名稱檢查標準檢查結果XXX 電子天平標準操作與維護規程已批準生效是 否XXX 型高效液相色譜儀標準操作與維護規程已批準生效是 否偏差處理標準管理規程已批準生效是 否變更控制標準管理規程已批準生效是 否是否存在偏差或不一致項：是偏差或不一致記錄在偏差報告中，偏差編號：。否結論：相關 SOP 均已批準生效。檢查人 / 日期復核人 / 日期附表 04: 藥品確認記錄名稱批號來源符合要求覆盆子留樣室是 否椴樹苷對照品中國食品藥品檢定研究院是 否鞣花酸對照品中國食品藥品檢定研究院是 否山柰酸 -3-

22、O- 蕓香糖苷對照品中國食品藥品檢定研究院是 否是否存在偏差或不一致項：是偏差或不一致記錄在偏差報告中，偏差編號：。否結論：樣品、對照品符合要求。檢查人 / 日期復核人 / 日期附表 05: 鑒別方法確認記錄人員項目薄層點樣溫度濕度圖譜判定標準結果符專業資料板方式合要求供試品與對照品色譜相專屬見應的位置上，顯相同顏是市售手動性05-1色的斑點；陰性液不顯否斑點。是否存在偏差或不一致項：是偏差或不一致記錄在偏差報告中，偏差編號：。否結論：椴樹苷鑒別分析方法已確認符合規定。檢查人 / 日期復核人 / 日期附表 06: 鞣花酸含量測定方法確認記錄色譜柱柱溫檢測器波長流動相進樣量系統適用性確認項目理論

23、板數專業資料對照品 1對照品 2供試品 1供試品 2鞣花酸可接受標準按鞣花酸峰計算應不低于 3000是否符合規定是否是否項目分離度對照品 1對照品 2供試品 1供試品 2鞣花酸可接受標準與相鄰色譜峰之間的分離度應大于1.5是否符合規定是否是否項目重復性對照品 1 RSD 值對照品 2 回收率鞣花酸可接受標準5 針峰面積的相對標準偏差（ RSD 值）應不大于2.0%；對照品溶液 2 的回收率應在 98.0% 102.0%是否符合規定是否是否項目保留時間空白溶劑對照品溶液供試品溶液鞣花酸空白溶劑在相應保留時間處沒有峰；供試品與對照品在相應保留時可接受標準間處出現峰。是否符合規定是否是否含量測定確認平均峰面積項目對照品 1對照品 2供試品 1供試品 2專業資料鞣花酸含量測定結果供試品 1供試品 2平均值可接受標準：按干燥品計算，含鞣花酸（C 14 H6 O 8）不得少于 0.20% 。是否符合規定是否是否存在偏差或不一致項：是偏差或不一致記錄在偏差報告中，偏差編號：。否結論：覆盆子的鞣花酸含量測定分析方法已確認符合規定。檢查人 / 日