1、收稿日期:2002-05-16基金項(xiàng)目:國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展規(guī)劃項(xiàng)目(973基金(G 2000056909文章編號(hào):100126325(20020620504204基因治療的新型載體研究進(jìn)展馬大龍(北京大學(xué)人類疾病基因研究中心,北京100083摘要:建立和發(fā)展一個(gè)安全及有效的載體系統(tǒng)對(duì)基因治療是極其重要的。盡管病毒載體已經(jīng)在臨床上用于基因治療,但其安全性仍然不確切。近年來,許多非病毒性基因載體系統(tǒng)已被廣泛開展及應(yīng)用。本綜述將討論一些新的基因載體系統(tǒng),特別是本實(shí)驗(yàn)室開展研究的載體系統(tǒng),包括細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)肽、電脈沖導(dǎo)入系統(tǒng)、殼聚糖載體等。關(guān)鍵詞:載體系統(tǒng);基因治療;質(zhì)粒DNA中圖分類號(hào):R45919文獻(xiàn)

2、標(biāo)識(shí)碼:A自從第一例在臨床上應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體治療重癥聯(lián)合免疫缺陷綜合征以來,迄今已經(jīng)有10余年的時(shí)間。在此期間,基因治療的載體系統(tǒng)的研究與開發(fā)獲得了長足的進(jìn)展,特別是由于病毒性載體在臨床上暴露出的一系列安全問題,使得非病毒載體的研究越來越受到重視,建立和發(fā)展高效、安全、可控、簡便、實(shí)用的基因治療載體系統(tǒng),已經(jīng)成為心血管疾病基因治療的熱點(diǎn)課題。本綜述將重點(diǎn)介紹近年來發(fā)展的一些新型基因治療的載體系統(tǒng),特別是本實(shí)驗(yàn)室在973計(jì)劃支持下開展研究的載體系統(tǒng),包括細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)肽、電脈沖導(dǎo)入系統(tǒng)、殼聚糖載體等。1細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)肽介導(dǎo)的基因?qū)胂到y(tǒng)1988年,G reen 等人首先發(fā)現(xiàn)人類免疫缺陷病毒(HI V 的T

3、 AT 蛋白可以進(jìn)入細(xì)胞和細(xì)胞核1。以后又不斷發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)如單皰疹病毒(HS V 的VP22、果蠅轉(zhuǎn)錄因子Antp 、H BV 的前S 抗原等可以進(jìn)入細(xì)胞。這一類蛋白中的特定結(jié)構(gòu)域(一般1030個(gè)氨基酸對(duì)其進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮主要作用。如果將這一結(jié)構(gòu)域與其它的蛋白、多肽、寡核苷酸等化合物結(jié)合或融合表達(dá),可以使這些生物大分子以非受體依賴方式進(jìn)入細(xì)胞。這些具有攜帶生物大分子進(jìn)入細(xì)胞的多肽統(tǒng)稱為細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)肽(Transduction peptide 或蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能區(qū)(protein transduction domain ,PT D 。有關(guān)細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)肽介導(dǎo)蛋白質(zhì)分子進(jìn)入細(xì)胞的研究請(qǐng)參考筆者的另一篇綜述2,本

4、文重點(diǎn)介紹細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)肽介導(dǎo)的基因?qū)胂到y(tǒng)的研究進(jìn)展。由于細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)肽往往為疏水性較強(qiáng)的堿性多肽,并含有核定位信號(hào)(N LS ,將其與DNA 形成復(fù)合物后,可以促進(jìn)DNA 與細(xì)胞膜的融合、內(nèi)吞,并有可能直接導(dǎo)入到細(xì)胞核中,使DNA 表達(dá)效率提高。近年來,已經(jīng)有較多的文獻(xiàn)報(bào)道利用細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)肽或蛋白將DNA 導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)或體內(nèi),為基因治療開辟新的導(dǎo)入途徑。Schuster 等人報(bào)道利用水皰性口炎病毒G 蛋白的多肽序列(K FTI VFPH NQGHWK NVPS NYHY 2CP 與asialooros omucoid 2多聚賴氨酸的復(fù)合物能夠在體內(nèi)促進(jìn)基因?qū)氲礁闻K并能高效表達(dá),為肝臟疾病的基因治療提供了

5、新途徑3。Esser 等人針對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)肽價(jià)格昂貴、穩(wěn)定性差的問題,利用嗜熱菌Therm otoga maritima 的組蛋白樣蛋白為載體,可以有效地將雙鏈DNA 導(dǎo)入細(xì)胞,其顯著優(yōu)點(diǎn)是這種蛋白具有高度的穩(wěn)定性,并且能夠在大腸桿菌中低成本的批量生產(chǎn)4。Rittner 等人設(shè)計(jì)了20個(gè)氨基酸兩性多肽ppTG 1和ppTG 20,在小鼠模型中證明ppTG 1和ppTG 20與質(zhì)粒DNA 形成復(fù)合物后,能高效率地使綠色熒光蛋白基因在肺部表達(dá)5。Eguchi 等人設(shè)計(jì)了一個(gè)新的利用T AT 轉(zhuǎn)導(dǎo)肽將DNA 導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的策略,稱之為T AT 2Phage 系統(tǒng),即利用(噬菌體表面表達(dá)T AT多肽,

6、噬菌體本身攜帶哺乳動(dòng)物表達(dá)元件控制的報(bào)告基因。結(jié)果表明,T AT2Phage系統(tǒng)能夠有效地將報(bào)告基因?qū)爰?xì)胞表達(dá),對(duì)細(xì)胞本身無任何毒性作用。如果換用其它靶向性多肽如整合素多肽或核定位信號(hào)則不能檢測到報(bào)告基因的表達(dá)。這一技術(shù)為體內(nèi)基因治療的新載體開發(fā)提供了基礎(chǔ)6。M orris等人報(bào)道,利用HI V21的gp41疏水性多肽和S V40大T抗原的核定位信號(hào)合成的MPG 多肽,能夠與DNA形成復(fù)合物,保護(hù)其不被降解,并且在血清中可以穩(wěn)定存在,可將質(zhì)粒DNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)或體內(nèi)表達(dá)。作者相信MPG可以成為基因治療的新有效途徑7。本課題組在973計(jì)劃的支持下,利用硫氧還原蛋白和本實(shí)驗(yàn)室克隆的凋亡相關(guān)分子TF

7、AR198為靶分子,分別進(jìn)行了不同細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)肽的導(dǎo)入效率研究,包括T A T、VP22、抗DNA抗體V片段等,獲得了促進(jìn)靶分子進(jìn)入細(xì)胞的效應(yīng)。進(jìn)一步將尋找新的靶分子和高效低毒的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)肽,最終希望能發(fā)現(xiàn)具有臨床心血管疾病治療意義的新型細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入體系。2電脈沖介導(dǎo)的裸DNA導(dǎo)入系統(tǒng)電脈沖刺激能夠在體外介導(dǎo)基因進(jìn)入細(xì)胞的現(xiàn)象,已經(jīng)廣為人知。1998年,Aihara首次報(bào)道了利用電脈沖刺激在體內(nèi)促進(jìn)裸DNA直接導(dǎo)入骨骼肌細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)結(jié)果9,證明電脈沖刺激可明顯提高質(zhì)粒在骨骼肌的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率(50150倍,因而電脈沖介導(dǎo)的裸DNA導(dǎo)入系統(tǒng)有可能成為新的基因治療導(dǎo)入系統(tǒng)。近年來,這一技術(shù)得到不斷地改進(jìn),例如

8、, Satkauskas等人對(duì)電脈沖介導(dǎo)的裸DNA導(dǎo)入系統(tǒng)的機(jī)理和最佳條件進(jìn)行了探索,通過報(bào)告基因的小鼠電脈沖骨骼肌導(dǎo)入,用51Cr2標(biāo)記的E DT A檢測細(xì)胞通透性,證明體內(nèi)的DNA導(dǎo)入是多步驟過程,包括DNA分布、肌細(xì)胞通透性增加,DNA電泳3個(gè)階段。而高低電壓脈沖的有效組合可能明顯提高DNA的導(dǎo)入效率10。McMahon等人發(fā)現(xiàn)電脈沖介導(dǎo)的裸DNA導(dǎo)入前,在骨骼肌局部注射透明質(zhì)酸酶可以明顯地增加DNA的轉(zhuǎn)染效率,同時(shí)減少了肌纖維損傷11。Matsum oto等利用家兔為模型,通過T型電極,成功建立了低電壓(20V以下的電脈沖刺激介導(dǎo)的頸動(dòng)脈質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染,獲得報(bào)告基因的表達(dá),持續(xù)至少14

9、d。這一技術(shù)為心血管疾病的基因治療提供了新的途徑12。近年來,本實(shí)驗(yàn)室、北醫(yī)心血管分子生物學(xué)研究所、北大生命科學(xué)院等在電脈沖介導(dǎo)的裸DNA導(dǎo)入系統(tǒng)的研究中,開展了較大量的工作,成功地將多種靶基因利用電脈沖導(dǎo)入動(dòng)物體內(nèi)并獲得高表達(dá),如CK LF113,14、胰島素15、CK LF2RP1、CK LF2RP2、紅細(xì)胞生成素16、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子17、促血管形成素2118等,為進(jìn)一步的基因治療研究打下了基礎(chǔ)。3殼聚糖介導(dǎo)的基因?qū)胂到y(tǒng)殼聚糖(Chitosan是將來自于自然界中廣泛存在的甲殼類動(dòng)物中的甲殼質(zhì)(chitin進(jìn)行脫乙酰化后得到的多糖類物質(zhì),已廣泛用于制藥、化妝品、食品等,是一種無毒、無

10、副作用的物質(zhì),具有生物粘附性、生物相容性和可降解性。目前,已有一些文獻(xiàn)報(bào)道利用殼聚糖可以在體內(nèi)或體外將質(zhì)粒DNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)或體內(nèi)組織,殼聚糖/DNA復(fù)合物可以形成納米顆粒,有效地導(dǎo)入細(xì)胞,其最大特點(diǎn)是安全性好,但導(dǎo)入效率尚有待提高。K ping2H ggard等人對(duì)殼聚糖與質(zhì)粒形成復(fù)合物的條件和結(jié)構(gòu)進(jìn)行了探索,證明殼聚糖能夠與DNA形成穩(wěn)定的復(fù)合物,抵抗血清的降解作用,并能在體內(nèi)體外表達(dá)報(bào)告基因,但表達(dá)動(dòng)力學(xué)研究表明,殼聚糖介導(dǎo)的基因表達(dá)出現(xiàn)較晚。作者特別強(qiáng)調(diào)了殼聚糖作為新的基因?qū)肫脚_(tái),其最大優(yōu)點(diǎn)是安全、無毒19。R oy等人利用殼聚糖與過敏原基因表達(dá)質(zhì)粒DNA形成的納米顆粒,給花生抗原致敏

11、的小鼠口服,獲得過敏原在腸道上皮的表達(dá),誘發(fā)產(chǎn)生分泌型IgA和血清IgG2a,使IgE 水平下降,有效抑制小鼠的食物變態(tài)反應(yīng),為變態(tài)反應(yīng)的DNA疫苗研究開辟了新道路20。本實(shí)驗(yàn)室近年在973計(jì)劃的支持下,開展了利用殼聚糖導(dǎo)入報(bào)告基因G FP的研究,證明其可以口服在腸道表達(dá)。與北京大學(xué)生命科學(xué)院唐建國教授合作研究發(fā)現(xiàn)殼聚糖與胰島素表達(dá)質(zhì)粒形成的復(fù)合物給小鼠口服,可以一過性降低血糖,這一結(jié)果有可能提供新的糖尿病治療途徑(待發(fā)表。4結(jié)語目前,非病毒的基因治療導(dǎo)入載體系統(tǒng)主要包括多肽或蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)、脂質(zhì)體導(dǎo)入系統(tǒng)、基因槍、電脈沖導(dǎo)入、殼聚糖基因?qū)胂到y(tǒng)等。它們各有優(yōu)勢,也各有不足之處(表121。雖然目

12、前的基因治療方案大部分采用病毒載體,但由于其安全性問題迄今尚未能完全釋疑,因而非病毒的基因治療載體系統(tǒng)越來越受到重視,目前已有脂質(zhì)體導(dǎo)入系統(tǒng)和基因槍系統(tǒng)開始進(jìn)入臨床,預(yù)料其它系統(tǒng)將會(huì)很快進(jìn)入臨床,如果能夠在導(dǎo)入效率和表達(dá)效率方面達(dá)到病毒性載體的水平,非病毒系統(tǒng)將有可能成為優(yōu)勢的基因治療技術(shù)。表1常用非病毒基因?qū)胂到y(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)T able1Advantages and Disadvantages of non2viral gene delivery systems Delivery system Advantages DisadvantagesProtein T ransduction D

13、omain (PT DReceptor,energy and transport independent,simultane2ous trans fer to large number of cells,in vivo applica2tions possibleS ize restriction in m olecules that can be trans2ferred,trans fer is accom panied by protein un fold2ingLipos ome2mediated trans fer H igh efficiency,little restrictio

14、ns in sam ple size,varietyof m olecules can be trans ferred,in vivo applicationspossible Interferes with lipid metabolism,unstable by long term storageG ene gun Applicable to wide range of cells,surface receptor inde2pendent,excellent for in vivo gene therapyS pecialized equipment neededE lectropora

15、tion Large number of target cells addressable,applicable to awide range of cells,little sam ple restrictions,high effi2ciency Requires specialized equipment,w orks best when cells are in suspension,proper delivery condition neededChitosan Safe,low toxicity,receptor,energy and transport inde2pendent,

16、oral delivery possible,in vivo applicationspossibleLower delivery efficiency,delayed expression 參考文獻(xiàn):1G reen M,Loewenstein P M.Autonom ous functional domains ofchemically synthesized human immunodeficiency virus T at trans2 activator proteinJ.Cell,1988,55:1179-1188.2馬大龍.細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)肽開啟細(xì)胞調(diào)控之門的鑰匙J.北京大學(xué)學(xué)報(bào),200

17、1,33(4:292.3Schuster M,Wu GY,Walton C M,.Multicomponent DNA car2rier with a vesicular stomatitis virus G2peptide greatly enhances liver2targeted gene expression in miceJ.Bioconjug Chem, 1999,10:1075-1083.4Esser D,Amanuma H,Y oshiki A,et al.A hypertherm ostablebacterial histone2like protein as an eff

18、icient mediator for trans2 fection of eukary otic cellsJ.Nature Biotech,2000,18:1211 -1213.5Rittner K,Benavente A,Bompard2S orlet A.New basic mem2brane2destabilizing peptides for plasmid2based gene delivery in vitro and in vivoJ.M olecular Therapy,2002,5:104-114.6Eguchi A,Akuta T,Okuyama H,et al.Pro

19、tein transductiondomain of HI V21tat protein prom otes efficient delivery of DNA into mammalian cellsJ.J Biol Chem,2001,276:26204-26210.7May C M,Laurent C,Jean M.A novel potent strategy for genedelivery using a single peptide vector as a carrierJ.Nucleic Acids Research,1999,3510-3517.8Liu H,Wang Y,Z

20、hang Y,et al.TFAR19,a novel apoptosis2related gene cloned from human leukemia cell line TF21,could enhance apoptosis of s ome tum or cells induced by growth factor withdrawalJ.Biochem Biophy Res C omm,1999,254:203-210.9Aihara H,Miyazaki J.G ene trans fer into muscle by electropo2ration in vivoJ.Nat

21、Biotechnol,1998,16:867-870. 10Satkauskas S,Bureau MF,Puc M,et al.Mechanisms of invivo DNA electrotrans fer:respective contributions of cell elec2 tropermeabilization and DNA E lectrophoresisJ.M ol Ther, 2002,5:133-140.11McMahon JM,S ignori E,Wells KE,et al.Optimisation ofelectrotrans fer of plasmid

22、into skeletal muscle by pretreatment with hyaluronidase2increased expression with reduced muscle damageJ.G ene Therapy,2001,8:1264-1270.12Matsum oto T,K om ori K,Shoji T,et al,Success ful and opti2mized in vivo gene trans fer to rabbit carotid artery mediated by electronic pulseJ.G ene Therapy,2001,

23、8:1174-1179. 13Han W L,Lou Y X,T ang JM,et al,M olecular cloning andcharacterization of chem okine2like factor1(CK LF1,a novel human cytokine with unique structure and potential chem otactic activityJ.Biochem J,2001,357:127-135.14徐志偉,鄧鴻業(yè),馬大龍.趨化因子樣因子21的體內(nèi)表達(dá)對(duì)BXS B狼瘡鼠發(fā)病影響的研究J.中華風(fēng)濕病學(xué)雜志,2001,5(3:162.15Y

24、in D,T ang J G.G ene therapy for streptozotocin2induced dia2betic mice by electroporational trans fer of naked human insulin precurs or DNA into skeletal muscle in vivoJ.FE BS,2001, 495:16-20.16陸小春,周愛儒,金彩科,等.電脈沖介導(dǎo)紅細(xì)胞生成素基因肌肉轉(zhuǎn)移治療大鼠腎性貧血J.中華醫(yī)學(xué)雜志, 2000,80(3:222.17魯東成,葉正茂,田學(xué)軍,等.肌肉電針介導(dǎo)VEG F基因治療大鼠閉塞性血管病J.科學(xué)

25、通報(bào),1999,44(9:958.18姜寧,高煒,王日勝,等.肌肉電轉(zhuǎn)促血管形成素21基因治療大鼠下肢血管閉塞病J.中國介入心臟病學(xué)雜志, 2001,9(2:101.19K ping2H ggard M,Tubulekas I,G uan H,et al.Chitosan asa nonviral gene delivery system.S tructure2property relation2ships and characteristics compared with polyethylenimine in vitro and after lung administration in v

26、ivoJ.G ene Therapy, 2001,8:1108-1121.20R oy K,Mao H Q,Huang SK,et al.Oral gene delivery withchitosan22DNA nanoparticles generates immunologic protection in a murine m odel of peanut allergyJ.Nat Med,1999,5: 387-391.21S tephens D J,Pepperkok R.The many ways to cross the plasmamembraneJ.PNAS,2001,98:4

27、295-4298.Novel DNA delivery systems for the gene therapyM A Da2long(Peking University Center for Human Disease G enomics,Beijing100083,ChinaAbstract:It is extremely im portant to establish and develop a safe and efficient delivery system for the gene therapy.Al2 though the virus vectors have been used for hundreds clinical trials