1、乙肝病毒檢測乙肝病毒檢測病毒鑒定方法一、分離培養方法二、快速診斷方法1、光學顯微鏡檢查 病毒包涵體及某些大病毒顆粒的檢查2、電子顯微鏡的檢查 電鏡直接檢查 免疫電鏡檢查3、血清學檢查4、病毒基因組檢查 核酸雜交和聚合酶鏈反應乙肝病毒檢測一、乙肝五項（兩對半）二、乙肝病毒核酸定量檢測 HBVHBV抗原抗體系統檢測臨床意義抗原抗體系統檢測臨床意義HBsAg抗抗-HBsHBeAg抗抗-HBe抗抗-HBc臨床意義臨床意義IgMIgG+-感染或無癥狀攜帶者感染或無癥狀攜帶者+-+-+-急性或慢性乙型肝炎（傳染性強）急性或慢性乙型肝炎（傳染性強） （大三陽）（大三陽）+-+-+急性肝炎趨向恢復急性肝炎趨向

2、恢復（小三陽）（小三陽）-+-+-+既往感染恢復期既往感染恢復期-+-+-既往感染恢復期既往感染恢復期-+既往感染既往感染-+-既往感染或接種疫苗既往感染或接種疫苗-未感染，無免疫力未感染，無免疫力二、乙肝病毒核酸定量檢測1.檢測原理檢測原理 利用熒光利用熒光PCR技術，以技術，以HBV基因組中相對保守區為基因組中相對保守區為靶區域，設計特異引物及熒光探針，通過靶區域，設計特異引物及熒光探針，通過PCR對對DNA進行快速定量檢測。進行快速定量檢測。 熒光探針熒光探針TaqMan 探針實時熒光探針實時熒光 PCR 技術。在技術。在 PCR 反應過程中，同時利用反應過程中，同時利用 Taq 酶的酶

3、的 53聚合酶活聚合酶活性和核酸外切酶活性，使得性和核酸外切酶活性，使得 TaqMan 探針降解，熒光探針降解，熒光報告基團和淬滅基團分離使得熒光信號發射，報告基團和淬滅基團分離使得熒光信號發射， FAM 熒熒光檢測乙型肝炎病毒光檢測乙型肝炎病毒JOE/RED610 nm 波長通道檢測波長通道檢測內參。內參。PCR分四個階段 Ct值的定義是PCR擴增過程中，熒光信號開始由本底進入指數增長階段的閾值所對應的循環次數。確定初始模板的濃度確定初始模板的濃度q初始初始 DNADNA量越多量越多, , 熒光熒光達到某一值（域值）時達到某一值（域值）時所需要的循環數越少所需要的循環數越少qLogLog濃度

4、與循環數呈線濃度與循環數呈線性關系，根據樣品擴增性關系，根據樣品擴增達到域值的循環數就可達到域值的循環數就可計算出樣品中所含的模計算出樣品中所含的模板量板量 。 SYBR Green 1 結合到雙鏈DNA的小溝部位 SYBR Green 1 染料只有和雙鏈DNA結合后才發熒光GTTTGGCCCCCCCAAAGGGACTTGATAGCATCGTAAGTTTTTTGGGGCCCCCCCCAAAAATACCGGGGTTACGAACG GTAAT未結合SYBR Green 1 dye2.所用試劑所用試劑組分組分名稱名稱規格規格數量數量主要成分主要成分 核酸核酸提取試劑提取試劑DNA提取提取液液I I4

5、.5ml/瓶瓶2DNA提取液提取液質質控品及陽性定量參考品控品及陽性定量參考品陰性質控品陰性質控品250ul/管管1HBV陰性血清陰性血清強陽性質控品強陽性質控品250ul/管管1滅活滅活HBV陽性血清陽性血清臨界陽性質控品臨界陽性質控品250ul/管管1滅活滅活HBV陽性血清陽性血清HBV定量參考品（定量參考品（2.0X106IU/ml）250ul/管管1滅活滅活HBV陽性血清陽性血清HBV定量參考品（定量參考品（2.0X105IU/ml）250ul/管管1滅活滅活HBV陽性血清陽性血清HBV定量參考品（定量參考品（2.0X104IU/ml）250ul/管管1滅活滅活HBV陽性血清陽性血清H

6、BV定量參考品（定量參考品（2.0X103IU/ml）250ul/管管1滅活滅活HBV陽性血清陽性血清 PCR檢測試劑檢測試劑HBV-內標溶液內標溶液100ul/管管1內標質粒及穩定劑內標質粒及穩定劑HBV-PCR反應管反應管1人一份人一份/管管20引物、探針、引物、探針、taq酶酶等等3、實驗步驟、實驗步驟1.DNA提取 將待測樣本、陽性定量參考品陽性定量參考品、陰性質控品、陰性質控品、HBV強陽性質強陽性質控品、控品、 HBV臨界質控品進行同步處理。臨界質控品進行同步處理。1.1 取200 L樣品，加入450 L DNA提取液提取液I I和和4 L內標溶液，用振蕩器劇烈震蕩搖勻15秒，瞬時

7、離心數秒，100處理10分鐘1.2 12000rpm離心5分鐘，備用2.PCR試劑準備直接使用HBV-PCR反應管反應管3. 加樣加樣HBV-PCR反應管反應管分別加入分別加入將待測樣本、陽性定量參考品陽性定量參考品、陰性、陰性質控品、質控品、HBV強陽性質控品、強陽性質控品、 HBV臨界質控品上清臨界質控品上清20 L。蓋緊管蓋，8000rpm離心數秒后擴增4.PCR擴增擴增對各標本進行標記對各標本進行標記反應條件：反應條件：93 2 2分鐘分鐘93 45 45秒秒55 6055 60秒秒1010個循環個循環93 30 30秒秒45 6045 60秒秒3030個循環個循環FAMFAM通道檢測

8、通道檢測HBVHBV核酸，核酸，VICVIC通道檢測內標通道檢測內標4.結果判定結果判定1 如果在如果在FAM檢測通道檢測擴增曲線無明顯對數期或檢測通道檢測擴增曲線無明顯對數期或Ct值等于值等于30，VIC檢測通道擴增曲線有明顯對數期，檢測通道擴增曲線有明顯對數期，則為陰性或小于檢測靈敏度則為陰性或小于檢測靈敏度2 FAM檢測通道擴增曲線有明顯對數期且檢測通道擴增曲線有明顯對數期且Ct值小于值小于30按以下方法判斷：按以下方法判斷：C100,HBV DNA100,HBV DNA濃度濃度100 IU/ml5.0E+008 ,HBV DNA5.0E+008 ,HBV DNA濃度濃度5.0X105.

9、0X108 8 IU/ml IU/ml 如需精確如需精確定量結果，可將樣品用陰性質控品稀釋到線性范圍后定量結果，可將樣品用陰性質控品稀釋到線性范圍后再檢測，則樣品再檢測，則樣品HBV DNAHBV DNA濃度濃度= =（CXCX稀釋倍數）稀釋倍數） IU/ml IU/ml5.注意事項1 每次實驗需檢測陰性質控品、陰性質控品、HBV強陽性質控品、強陽性質控品、 HBV臨界質控品，滿足要求方可進行判定（陽性質控臨界質控品，滿足要求方可進行判定（陽性質控品品Ct3030，陰性質控品，陰性質控品無明顯對數期或Ct值等于30 VIC檢測通道擴增曲線有明顯對數期）2 本試劑盒的最低檢出濃度為30IU/ml

10、IU/ml，最低定量濃，最低定量濃度為度為100IU/ml100IU/ml3 3 所有樣品包括質控品均按傳染性標本對待嚴格遵循所有樣品包括質控品均按傳染性標本對待嚴格遵循無菌操作（帶口罩手套），所有操作在生物安全柜內無菌操作（帶口罩手套），所有操作在生物安全柜內操作，物品不能隨意帶出生物安全柜，用完的物品集操作，物品不能隨意帶出生物安全柜，用完的物品集中放置高壓滅菌后方可處置。中放置高壓滅菌后方可處置。一、乙肝病毒e抗原檢測1.檢測原理檢測原理 在微孔板上預包被鼠抗在微孔板上預包被鼠抗-Hbe單克隆抗體（單克隆抗體（ HbeAb），），配以辣根過氧化物酶標鼠抗配以辣根過氧化物酶標鼠抗-Hbe單

11、克隆抗體單克隆抗體（ HbeAb-HRP）及）及TMB（四甲基聯苯胺）等試劑，（四甲基聯苯胺）等試劑，采用雙抗夾心法檢測血清中的采用雙抗夾心法檢測血清中的乙肝病毒乙肝病毒e抗原抗原（ HbeAg）2.所用試劑所用試劑組成成分組成成分規格規格組成成分組成成分規格規格1.HbeAg微孔板微孔板（包被鼠抗（包被鼠抗-Hbe單克隆抗體單克隆抗體（ HbeAb）96TX塊塊7.底物底物B（過氧化氫）（過氧化氫）7mlX1支支2.HbeAg酶標抗酶標抗體體（辣根過氧化（辣根過氧化物酶標鼠抗物酶標鼠抗-Hbe單克隆抗體）單克隆抗體）3.5mlX1支支8.終止液終止液7mlX1支支3.HbeAg陽性對陽性對照

12、血清照血清（含（含HbeAg陽性陽性血清）血清）1mlX1支支9.封口膜封口膜2張張4.HbeAg陰性對陰性對照血清照血清（正常人血清）（正常人血清）1mlX1支支10.自封袋自封袋1個個5.濃縮洗滌濃縮洗滌（PBS-T緩沖液）緩沖液）12.5mlX1支支11. 說明書說明書1張張6.底物底物A（過氧化氫）（過氧化氫）7mlX1支支 3、實驗步驟、實驗步驟1.平衡 試劑盒個組分取出，平衡至室溫（16-25）余者以自封袋封存2.配液配液 濃縮洗滌液搖勻后，用蒸餾水或去離子水按濃縮洗滌液搖勻后，用蒸餾水或去離子水按1:19稀釋備用稀釋備用3. 編號編號 微孔條固定于支架，按序編號微孔條固定于支架，

13、按序編號4.加樣加樣 分別用加樣器加入陽性對照血清、陰性對照血清分別用加樣器加入陽性對照血清、陰性對照血清50 L（各加兩孔），待測血清50 L（1孔），空白對照（不加）5.加酶加酶 每空加酶標抗體每空加酶標抗體50 L，混勻（空白對照不加），混勻（空白對照不加）6.溫浴溫浴 37溫浴溫浴2525分鐘，室溫平衡分鐘，室溫平衡5 5分鐘（封口膜覆蓋孔口，避免其分鐘（封口膜覆蓋孔口，避免其他因素影響）他因素影響）7.洗滌洗滌 洗滌液充分洗滌洗滌液充分洗滌5次，洗滌完扣干（每次應保持次，洗滌完扣干（每次應保持30-60秒的浸秒的浸泡時間）泡時間）8.顯色顯色 每孔加入每孔加入A、B底物底物50 L，

14、混勻，混勻，37暗置暗置1515分鐘分鐘9.終止終止 每孔加每孔加50 L終止液終止液50 L，混勻，混勻10.測定測定 酶標儀單波長酶標儀單波長450nm或雙波長或雙波長450/630nm測定各空測定各空OD值，記值，記錄結果錄結果,30分鐘內測定完成）分鐘內測定完成）4.結果判定結果判定1. 臨界值臨界值(C.O)計算計算 臨界值臨界值=陰性對照孔陰性對照孔OD值均值值均值N X 2.1 X 2.1 注意：陰性對照孔注意：陰性對照孔均值均值N大于大于0.1應重新實驗，小于應重新實驗，小于0.05按按0.05計算計算2. 結果判定結果判定樣品樣品OD值值/ C.O 11為為HbeAg陽性陽性

15、樣品樣品OD值值/ C.O 1 1為為HbeAg陽性陽性3.陰性對照孔陰性對照孔均值均值N大于大于0.1或陽性對照均值或陽性對照均值0.40.4實實驗無效，驗無效，應重新實驗應重新實驗5.注意事項注意事項1. 1. 洗滌時各孔均加滿，防止孔內有游離酶未洗凈影洗滌時各孔均加滿，防止孔內有游離酶未洗凈影響結果響結果2. 2. 所有樣品包括質控品均按傳染性標本對待嚴格遵所有樣品包括質控品均按傳染性標本對待嚴格遵循無菌操作（帶口罩手套），所有操作在生物安全柜循無菌操作（帶口罩手套），所有操作在生物安全柜內操作，物品不能隨意帶出生物安全柜，用完的物品內操作，物品不能隨意帶出生物安全柜，用完的物品集中放置

16、高壓滅菌后方可處置。集中放置高壓滅菌后方可處置。3.3.微孔板拆封后，取出當天用的微孔條后，其余用封微孔板拆封后，取出當天用的微孔條后，其余用封口膜封存避免受潮口膜封存避免受潮PCR分四個階段 Ct值的定義是PCR擴增過程中，熒光信號開始由本底進入指數增長階段的閾值所對應的循環次數。4.結果判定結果判定1 如果在如果在FAM檢測通道檢測擴增曲線無明顯對數期或檢測通道檢測擴增曲線無明顯對數期或Ct值等于值等于30，VIC檢測通道擴增曲線有明顯對數期，檢測通道擴增曲線有明顯對數期，則為陰性或小于檢測靈敏度則為陰性或小于檢測靈敏度2 FAM檢測通道擴增曲線有明顯對數期且檢測通道擴增曲線有明顯對數期且

17、Ct值小于值小于30按以下方法判斷：按以下方法判斷：C100,HBV DNA100,HBV DNA濃度濃度100 IU/ml5.0E+008 ,HBV DNA5.0E+008 ,HBV DNA濃度濃度5.0X105.0X108 8 IU/ml IU/ml 如需精確如需精確定量結果，可將樣品用陰性質控品稀釋到線性范圍后定量結果，可將樣品用陰性質控品稀釋到線性范圍后再檢測，則樣品再檢測，則樣品HBV DNAHBV DNA濃度濃度= =（CXCX稀釋倍數）稀釋倍數） IU/ml IU/ml2.所用試劑所用試劑組成成分組成成分規格規格組成成分組成成分規格規格1.HbeAg微孔板微孔板（包被鼠抗（包被鼠

18、抗-Hbe單克隆抗體單克隆抗體（ HbeAb）96TX塊塊7.底物底物B（過氧化氫）（過氧化氫）7mlX1支支2.HbeAg酶標抗酶標抗體體（辣根過氧化（辣根過氧化物酶標鼠抗物酶標鼠抗-Hbe單克隆抗體）單克隆抗體）3.5mlX1支支8.終止液終止液7mlX1支支3.HbeAg陽性對陽性對照血清照血清（含（含HbeAg陽性陽性血清）血清）1mlX1支支9.封口膜封口膜2張張4.HbeAg陰性對陰性對照血清照血清（正常人血清）（正常人血清）1mlX1支支10.自封袋自封袋1個個5.濃縮洗滌濃縮洗滌（PBS-T緩沖液）緩沖液）12.5mlX1支支11. 說明書說明書1張張6.底物底物A（過氧化氫）（過氧化氫）7mlX1支支 5.注意事項注意事項1