1、 山東大學實驗報告 2015年 12 月 7日姓名 黃新迪 系年級 2014級生科3班 組別 5 同組者 高巖、國文潔、梁蕭科目 微生物學實驗 題目 微生物的生理生化反應 微生物的生理生化反應一、【實驗目的】1. 證明不同微生物對各種有機大分子物質的水解能力不同，從而說明不同微生物有著不同的酶系統。2.掌握進行微生物大分子物質水解試驗的原理和方法。3.了解糖發酵的原理和在腸細菌堅定中的重要作用。4.掌握通過糖發酵鑒別不同微生物的方法。5. 了解吲哚和甲基紅試驗的原理以及其在腸道細菌鑒定中的意義和方法。二、【實驗儀器與試劑】菌種：枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌、普通變形桿菌、產氣腸桿菌培養

2、基：培養基：固體淀粉培養基、固體油脂培養基（大分子水解試驗）；葡萄糖發酵培養基、乳糖發酵培養基（內裝有倒置的德漢氏小管）（糖發酵試驗）；蛋白胨水培養基（吲哚試驗）；葡萄糖蛋白胨水培養基；試劑：盧戈氏碘液、乙醚、吲哚試劑、甲基紅試劑、蒸餾水、儀器：酒精燈、接種針、培養皿、試管、試管架、燒杯、量筒、德漢氏小管三、【實驗原理】1.在所有生活細胞中存在的全部生物化學反應稱之為代謝，代謝過程主要是酶促反應過程，由于各種微生物具有不同的酶系統，所以他們能利用的底物不同，或雖利用相同的底物但產生的代謝產物卻不同，因此可以利用各種生理生化反應來鑒別不同的細菌，尤其是在腸桿菌科細菌的鑒定中，生理生化試驗占有重要

3、的地位。2.淀粉的水解：由于微生物對淀粉這種大分子物質不能直接利用，必須靠產生的胞外酶將大分子物質分解才能被微生物吸收利用.胞外酶主要為水解酶,通過加水裂解大的物質為較小的化合物,使其能被運輸至細胞內.如淀粉酶水解淀粉為小分子的糊精,雙糖和單糖；而淀粉遇碘液會產生藍色，因此能分泌胞外淀粉酶的微生物，則能利用其周圍的淀粉，在淀粉培養基上培養用碘處理其菌落周圍不呈藍色，而是無色透明圈，據此可分辨微生物能否產生淀粉酶。3.油脂的水解：在油脂培養基上接種細菌，培養一段時間后觀察菌苔的顏色，若出現紅色斑點，則說明此中菌可產生分解油脂的酶。4. 糖發酵試驗：糖發酵試驗是常用的鑒別微生物的生化反應,在腸道細

4、菌的鑒定上尤為重要.絕大多數細菌都能利用糖類作為碳源和能源,但是它們在分解糖類物質的能力上有很大的差異.有些細菌能分解某種糖產生有機酸(如乳酸,醋酸,丙酸等)和氣體(如氫氣,甲烷,二氧化碳等);有些細菌只產酸不產氣.例如大腸桿菌能分解乳糖和葡萄糖產酸并產氣。產酸后再加入溴甲酚指示劑后會使溶液呈黃色，且德漢氏小管中會收集到一部分氣體。若細菌不能使糖產酸產氣，則最后溶液為指示劑的紫色，且德漢氏小管中無氣體。5.IMVC實驗主要用于快速鑒別大腸桿菌和產氣腸桿菌。（1）吲哚試驗：是用來檢測吲哚的產生，在蛋白胨培養基中，若細菌能產生色氨酸酶，則可將蛋白胨中的色氨酸分解為丙酮酸和吲哚，吲哚與對二甲基苯甲醛

5、反應生成玫瑰色的玫瑰吲哚。但并非所有的微生物都具有分解色氨酸產生吲哚的能力，所以吲哚實驗可以作為一個生物化學檢測的指標。大腸桿菌吲哚反應陽性，產氣腸桿菌為陰性。（2）甲基紅試驗（MR）：某些細菌在糖代謝過程中分解葡萄糖生成丙酮酸，后者進而被分解產生甲酸，乙酸和乳酸等多種有機酸，培養基就會變酸，使加入培養基中的甲基紅指示劑由橙黃色轉變為紅色，即甲基紅反應。大腸桿菌為陽性，產氣腸桿菌為陰性。四、【實驗步驟】1. 淀粉水解實驗（1）倒平板：按照淀粉培養基配方配制固體淀粉培養基，滅菌，待培養基冷卻至50左右，在酒精燈火焰旁倒平板，每組兩個平板。 （2）用記號筆在平板底部劃成四部分。 （3）接種：在無菌

6、操作臺上，將枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌分別在不同的部分點種，如圖一所示，注意僅用接種針接觸極少面積的培養基，在平板的反面對應部分貼上標簽，標簽上分別寫上菌名，以免混淆。 （4）培養：將平板倒置，在28溫箱中培養兩天。 （5）觀察：取出培養基，觀察各種細菌的生長情況，打開平板蓋子，滴入少量盧戈氏碘液于平板中，輕輕旋轉平板，使碘液均勻鋪滿整個平板，觀察培養皿中菌落周圍是否有無色透明圈，若有無色透明圈出現，說明淀粉已經被水解，為陽性，反之則為陰性。記錄實驗結果。 圖一：淀粉水解試驗接種示意圖 圖二：油脂水解試驗接種示意圖2.油脂水解試驗（1）倒平板：按照油脂培養基配方配制固

7、體油脂培養基，滅菌，待培養基冷卻至50左右，充分振蕩，使油脂均勻分布，在酒精燈火焰下倒平板，每組兩個平板。 （2）用記號筆在在平板底部劃成四部分。 （3）接種：在無菌操作臺上將枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌分別劃十字線接種于平板相對應部分的中心，如圖二所示，并貼好標簽，標簽上注明菌種的名稱。 （4）培養：將平板倒置，在28溫箱中培養兩天。（5）觀察：取出平板，觀察菌苔顏色，如果出現紅斑點，說明脂肪水解，為陽性反應。記錄實驗結果。3.葡萄糖發酵實驗 （1）培養基的配制：按照糖發酵培養基配置葡萄糖發酵培養基，分裝至試管中，用膠頭滴管往德漢氏小管中注滿培養基，再把德漢氏小管倒置

8、放入試管中，注意不要讓德漢氏小管中進入空氣，每組五只試管，滅菌。（2）接種：待培養基冷卻至常溫時，在無菌操作臺上，取葡萄糖發酵培養基試管2支接入大腸桿菌，再取兩只接入普通變形桿菌，接種后輕搖試管，使其均勻，防止倒置的小管進入氣泡，第五支不接種，作為對照。在各試管外壁上貼上標簽，標簽上分別標明發酵培養基的名稱和所接種的細菌菌名。 （3）培養：把接種后的試管放在試管架上，把試管連同試管架放入培養箱中于28下培養兩天。（4）觀察：觀察各試管顏色變化及德漢氏小管中有無氣泡，并記錄實驗結果。 4.乳糖發酵實驗（1）培養基的配制：按照糖發酵培養基配置乳糖發酵培養基，分裝至試管中，用膠頭滴管往德漢氏小管中注

9、滿培養基，再把德漢氏小管倒置放入試管中，注意不要讓德漢氏小管中進入空氣，每組五只試管，滅菌。（2）接種：待培養基冷卻至常溫時，在無菌操作臺上，取乳糖發酵培養基試管2支接入大腸桿菌，再取兩只接入普通變形桿菌，接種后輕搖試管，使其均勻，防止倒置的小管進入氣泡第五支不接種，作為對照。在各試管外壁上貼上標簽，標簽上分別標明發酵培養基的名稱和所接種的細菌菌名。 （3）培養：把接種后的試管放在試管架上，把試管連同試管架放入培養箱中于28下培養兩天。（4）觀察：觀察各試管顏色變化及德漢氏小管中有無氣泡，并記錄實驗結果。5.吲哚試驗 （1）培養基的配制：按照蛋白胨水培養基配方配制培養基，分裝至試管中，每組五只

10、試管，在高壓蒸氣鍋內滅菌。（2）接種：待培養基冷卻后，在無菌操作臺上將大腸桿菌接入2支蛋白胨水培養基，產氣腸桿菌接入2支蛋白胨水培養基，剩余一只試管不接種，作為空白對照，貼好標簽。（3）培養：把接種后的試管放在試管架上，把試管連同試管架放入培養箱中于28下培養兩天。（4）觀察：往培養后的蛋白胨水培養基內加入34滴乙醚，搖動數次，靜置1min，待乙醚上升后，沿試管避徐徐加入2滴吲哚試劑。在乙醚和培養物之間產生紅色環狀物為陽性反應。觀察加入試劑后試管內的顏色反應并記錄實驗結果。 6.甲基紅試驗 （1）培養基的配制：按照葡萄糖蛋白胨水培養基配方配制培養基，分裝至試管中，每組五只試管，在高壓蒸氣鍋內滅

11、菌。（2）接種：待培養基冷卻后，在無菌操作臺上將大腸桿菌接入2支葡萄糖蛋白胨水培養基，產氣腸桿菌接入2支葡萄糖蛋白胨水培養基，剩余一只試管不接種，作為空白對照，貼好標簽。（3）培養：把接種后的試管放在試管架上，把試管連同試管架放入培養箱中于28下培養兩天。（4）觀察：培養兩天后后，將每支葡萄糖蛋白胨水培養基培養物內加入2滴甲基紅試劑，培養基變為紅色者為陽性，變為黃色者為陰性。觀察試管內的顏色變化，并記錄實驗結果。五、【實驗結果及分析】實驗結果記錄淀粉水解試驗:表1.淀粉水解試驗結果(“+”表示陽性，“”表示陰性)菌種陰 / 陽性結論大腸桿菌+可以水解淀粉枯草芽孢桿菌+可以水解淀粉變形桿菌-不可

12、以水解淀粉銅綠假單胞菌+可以水解淀粉油脂水解試驗:表2. 油脂水解試驗結果(“+”表示陽性，“”表示陰性)菌種陰 / 陽性結論大腸桿菌+可以水解油脂枯草芽孢桿菌+可以水解油脂變形桿菌-不以水解油脂銅綠假單胞菌+可以水解油脂葡萄糖發酵培養基：表3. 葡萄糖發酵試驗結果（“+”表示陽性，“”表示陰性）樣品大腸桿菌普通變形桿菌空白試管1試管2試管3試管4試管5顏色變化黃色黃色紫色是否產氣是是否陰/陽性+-結論大腸桿菌可以分解葡萄糖，同時產酸產氣。普通變形桿菌能分解葡萄糖，同時產酸產氣。對照組乳糖發酵培養基:表4. 乳糖發酵試驗結果（“+”表示陽性，“”表示陰性）樣品大腸桿菌普通變形桿菌空白試管1試管

13、2試管3試管4試管5顏色變化黃色紫色紫色是否產氣是否否陰/陽性+-結論大腸桿菌能分解乳糖，故產酸產氣。普通變形桿菌不能分解乳糖，故不產酸不氣。對照組吲哚試驗:表5.吲哚試驗結果（“+”表示陽性，“”表示陰性）樣品大腸桿菌產氣腸桿菌試管1試管2試管3試管4是否產生紅色環狀物否否陰/陽性-結論大腸桿菌不可以分解色氨酸為吲哚產氣腸桿菌不能分解色氨酸為吲哚甲基紅試驗:表6. 甲基紅試驗結果（“+”表示陽性，“”表示陰性）樣品大腸桿菌產氣腸桿菌試管1試管2試管3試管4顏色變化變紅變紅陰/陽性+結論大腸桿菌在培養期仍維持酸性pH產氣腸桿菌在培養期仍維持酸性pH淀粉分解實驗結果 油脂分解實驗結果 葡萄糖發酵

14、實驗結果 乳糖發酵實驗結果 甲基紅實驗結果 吲哚實驗結果六、【注意事項】1.淀粉水解試驗中，觀察各種細菌生長情況時，滴入少量盧戈氏碘液于平板中，應輕輕旋轉平板，使碘液均勻鋪滿整個平板。2.油脂水解試驗中，制備固體油脂培養基時，應充分搖蕩，使油脂均勻分布。3.接種前要用記號筆做好標記，接種時要對號接種，以免接錯菌種，造成混亂。4.糖發酵試驗中，接種后要輕緩搖動試管，使其均勻，防止倒置的小管進入氣泡。否則會造成假象，得出錯誤的結果。5.吲哚試驗中，注意加入34滴乙醚，搖動數次，靜置1min，待乙醚上升后，再沿試管壁徐徐加入2滴吲哚試劑。否則就會觀察不到在乙醚和培養物之間產生的紅色環狀物。6.甲基紅

15、試驗中，應該注意甲基紅試劑不要加得太多，以免出現假陽性。7.在使用酒精燈時要特別注意，避免酒精燈爆炸。8. 接種均在無菌條件下操作，接種完畢以后用滅菌好的棉花塞住管口防止污染。七、【思考題】1. 你怎么樣解釋淀粉酶是胞外酶而非胞內酶？答：淀粉是大分子物質，進入細胞十分困難，甚至需要觸及高耗能的胞吞作用。因而通過胞外酶的作用，將淀粉水解為葡萄糖后運入細胞，較方便高效。試驗中菌苔周圍出現透明圈，說明培養基內淀粉被水解，可推測是細菌細菌將淀粉酶分泌到胞外所致，因此為胞外酶。2. 不利用碘液，你怎樣證明淀粉水解的存在？答：淀粉水解為葡萄糖才能被細胞利用，因此可以換用斐林試劑。呈陽性者則說明產生了葡萄糖

16、，淀粉被水解；陰性者說明淀粉未被水解。3. 假如某種微生物可以有氧代謝葡萄糖，發酵試驗應該出現什么結果？答：由于產生的CO2溶于水的量少且碳酸酸性若，因此顏色不變化，仍為紫色。德漢氏小管中有氣柱。4. 討論IMViC試驗在醫學檢驗上的意義。答：可以鑒別某些疾病是由大腸桿菌還是產氣腸桿菌引起的。5. 解釋在細菌培養中吲哚檢測的化學原理，為什么在這個試驗中用吲哚的存在作為色氨酸酶活性的指示劑，而不用丙酮酸？答：有些細菌產生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸，產生吲哚和丙酮酸。吲哚與對二甲基氨基甲醛結合，形成紅色的玫瑰吲哚。但并非所有的微生物都具有分解色氨酸產生吲哚的能力，因此吲哚試驗可以作為一個生物化

17、學檢測的指標。 因為丙酮酸是生物體呼吸作用的產物，無論是有氧還是無氧，都會產生丙酮酸，因而無法作為色氨酸酶活性的指示劑進行區分。 同時吲哚能通過有明顯顏色變化的化學反應觀測到，而丙酮酸不能，所以試驗中用吲哚的存在作為色氨酸酶活性的指示劑，而不用丙酮酸。 6.為什么大腸桿菌是甲基紅反應陽性？當細菌代謝糖產生酸時，培養基就會變酸，使加入培養基中的甲基紅指示劑由橙黃色（PH6.3）轉變為紅色（PH4.2），即甲基紅反應。而大腸桿菌和產氣腸桿菌在培養的早期均產生有機酸，但大腸桿菌在培養的后期仍能維持酸性PH4，而產氣腸桿菌則轉化有機酸為非酸性末端產物，如乙醇、丙酮酸等，使PH升至大約6。因此，大腸桿菌

18、為陽性，產氣腸桿菌為陰性。八、【實驗總結】各種細菌在代謝類型上表現了很大的差異。不同的細菌分解大分子碳水化合物、蛋白質和脂肪的能力不同，所能發酵的類型和最終產物也不一樣。不同細菌對營養的要求不同也說明了它們有不同的合成能力。所有這些都反映了它們是有不同的酶系統。細菌的這種生化反應的多樣性在自然界產生了兩種結果：第一、使自然界所有的有機分子都有可能得到分解；第二、使不同細菌之間有了互相作用和互相依賴的基礎，例如，一種微生物能利用另一種微生物所分解的產物。另一方面，細菌的生化反應的多樣性也被人們作為細菌的鑒定和分類方法來利用。本實驗是通過細菌對大分子物質的水解試驗、糖發酵試驗、鑒定腸道菌的其他不同生化反應等幾個實驗，來證明不同的細菌其