1、1適用范圍及標準1.1適用于生活飲用水、水源水、游泳池水中大腸菌群的測定。1.2技術標準gb/t 5749-2006 生活飲用水衛生標準gb/t 生活飲用水標準查驗方式微生物指標db 31/890-2021公共游泳場所衛生治理標準2檢測原理總大腸菌群指一群在37 、24 h 培育能發酵乳糖、產酸、產氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。耐熱大腸菌群指一群在44.5 仍能生長且發酵乳糖產酸、 產氣，需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。大腸埃希氏菌是指一群能生長發酵乳糖產酸、產氣且在含有熒光底物的培育基上培育 24 h 產生 -葡萄糖醛酸酶，分解熒光底物釋放出熒光產物，使培育基在紫外光下產生

2、特點性熒光的需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。3儀器和設備高壓蒸汽滅菌器冰箱： 2 8 恒溫培育箱： 36 1 天平3.5ph 試紙3.6恒溫水槽： 44.5 3.7生物平安柜3.8紫外光燈： 6w、波長 366nm 3.9平皿：直徑為 9cm 3.10試管3.11刻度吸管3.12小倒管金屬接種環4培育基和試劑4.1乳糖蛋白胨培育基： 稱取乳糖蛋白胨于蒸餾水中加熱溶解，充分混勻，分裝到帶有倒管的試管中 (每管 10 ml)， 115 高壓滅菌 20min。 （注：雙料乳糖蛋白胨即蒸餾水不變，乳糖蛋白胨的成份量加雙份。）4.2伊紅美蘭瓊脂平板： 稱取伊紅美蘭瓊脂， 加熱溶解，傾注滅菌平皿，每

3、皿約 15ml。冷凝后，倒置 4冰箱保留，待用。4.3革蘭氏染色液（染色方式見試劑利用說明書）4.4ec 培育基：稱取ec 培育基干粉，加熱溶解，調ph 為，分裝到帶有倒管的試管中 ( 每管 10ml)，121 高壓滅菌 20 min，備用。4.510 %（m/m）硫代硫酸鈉溶液： 121 高壓滅菌 20 min。乳糖膽鹽發酵培育管：稱取乳糖膽鹽，加熱溶解，調ph 至，分裝到帶有倒管的試管中(每管 5 ml),115 高壓滅菌 15 min。 （注：雙料乳糖膽鹽發酵管即蒸餾水不變，乳糖膽鹽加雙份。）ec-mug 管：稱取本培育基干粉，加熱溶解，在366nm 紫外光下檢查無自發熒光后分裝于試管中

4、， 115 高壓滅菌 20 min，最終 ph 為。5操作步驟5.1總大腸菌群5 管法：無菌吸取 10 ml 水樣加入雙料乳糖蛋白胨培育液中，取1 ml 水樣加入單料乳糖蛋白胨培育液中， 另取 1 ml 水樣加入 9 ml 生理鹽水中混勻作 10倍稀釋后取 1 ml(即ml 水樣)加入單料乳糖蛋白胨培育液中，每一稀釋度接種5 管。對已處置過的出廠自來水，需常常查驗或天天查驗一次的， 可直接接種五管雙料培育基， 每管接種 10 ml 水樣。15 管法：查驗水源水時，如污染嚴峻的水樣，應加大稀釋倍數，可接種1， ， ml乃至， ， ml，每一個稀釋度接種5管，每一個水樣共接種15 管。接種 1 m

5、l 以下水樣時，必需作 10倍稀釋后取 1 ml 接種。輕搖試管，使液體充分混勻，置36 1 培育箱中培育 24 h 。觀看每管是不是產酸、產氣，如不產酸也不產氣那么報告為大腸菌群陰性；假設液體變黃且有氣體產生那么為實驗陽性，需做進一步的證明實驗。平板分離：自實驗陽性管中取一接種環培育液，接種到伊紅美蘭瓊脂平板上，置36 1 培育箱中培育1824 h，觀看菌落形態，典型的大腸菌群菌落為黑紫色或紅紫色，具有金屬光澤。復發酵實驗：挑取可疑大腸菌群菌落進行革蘭氏染色，同時接種單料乳糖發酵管，置 36 1 培育箱中培育 24 h。結果報告：凡乳糖發酵管產酸、產氣，革蘭氏染色為陰性的無芽孢桿菌，為大腸菌

6、群陽性。記下實驗的陽性管數，查表得出100 ml 水樣中總大腸菌群的mpn 值。15 管法結果見附表 1，5 管法結果見附表 2，稀釋樣品查表后所得結果應乘以稀釋倍數。假設所有乳糖發酵管陰性，那么報告總大腸菌群未檢出。耐熱大腸菌群從測總大腸菌群乳糖發酵實驗中的陽性管（產酸產氣）中無菌取12接種環菌液轉種于 ec 培育基中，輕搖試管，使液體充分混勻，置恒溫水浴箱中（水浴箱的水面應高于試管中培育基的液面）44.5 培育 242 h。假設只檢測耐熱大腸菌群時，可用直接多管耐熱大腸菌群方式，即在第一步乳糖發酵實驗時按水中總大腸菌群檢測細那么（多管發酵法）或.2 接種乳糖蛋白胨培育液，置恒溫水浴箱中培育

7、 1824 h后，以下步驟同。觀看每管是不是產酸產氣，如不產酸產氣那么報告為耐熱大腸菌群陰性；假設產酸產氣那么為實驗陽性，需做進一步的證明實驗。平板分離：自實驗陽性管中取一接種環培育液， 接種到伊紅美蘭瓊脂平板上， 置 44.5 培育 1824 h，觀看菌落形態。復發酵實驗：自伊紅美蘭瓊脂平板上挑取可疑大腸菌群菌落進行革蘭氏染色，同時接種單料乳糖發酵管，置44.5 水浴箱中培育 24 h。結果報告：凡在 44.5 仍能發酵乳糖產酸、產氣，革蘭氏染色為陰性的無芽孢桿菌，為耐熱大腸菌群陽性。記下實驗的陽性管數，查總大腸菌群（mpn）檢索表報告每100 ml 水樣中耐熱大腸菌群的（mpn）數值。大腸

8、埃希氏菌接種：從測總大腸菌群多管發酵初發酵實驗中產酸或產氣的試管中無菌取12 接種環菌液轉種于ec-mug 管中，或是按總大腸菌群多管發酵初發酵實驗方式將待測樣品接種，從產酸產氣管中無菌取12 接種環菌液轉種于ec-mug 管中。輕搖試管，使液體充分混勻，置恒溫水浴箱中（水浴箱的水面應高于試管中培育基的液面）44.5 培育 242 h。培育：將已接種的ec-mug 管輕搖試管，使液體充分混勻，接種后30 min 內置恒溫水浴箱中（水浴箱的水面應高于試管中培育基的液面）44.5 培育242 h。結果觀看：培育時刻達到后，將ec-mug 管在暗處用波長為366nm 功率為 6w 的紫外燈照射，如有

9、藍色熒光產生那么表示水樣中含有大腸埃希氏菌。結果報告：計算ec-mug 陽性管數，查對應的最可能數（mpn ）表得出大腸埃希氏菌的最可能數，結果以 mpn/100 ml 報告。6注意事項6.1本實驗要在二級生物平安實驗室中進行。6.2實驗室成員應知曉潛在危害，熟悉實驗室平安操作規程和技術。6.3實驗室人員要避免針 /銳器損傷，利用銳器容器勿斷裂、彎折或從頭套上或重復利用注射器、針頭；禁止用手接觸破碎的玻璃器皿，盡可能利用塑料器皿。6.4工作終止后消毒工作臺面。7相關記錄7.1m-w-00201-2020生活飲用水中大腸菌群原始記錄附表 1總大腸菌群（ mpn ）檢索表（ 15 管法）接種量 /ml 總大腸菌群 /（mpn/100ml）接種量 /ml 總大腸菌群 /（mpn/100ml）10 1