第六章分子生物學(xué)基本操作技術(shù)第6章分子生物學(xué)技術(shù)第一節(jié)核酸的提取第二節(jié)核酸雜交技術(shù)第三節(jié)PCR技術(shù)第6章分子生物學(xué)技術(shù)第一節(jié)核酸的提取一、提取核酸的基本步驟（一）總則保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性；其他生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子的污染應(yīng)降低到最低程度；核酸樣品中不應(yīng)存在對(duì)酶有抑制作用的有機(jī)溶劑和過(guò)高濃度的金屬離子；應(yīng)盡量去除非目標(biāo)核酸分子。第6章分子生物學(xué)技術(shù)（二）措施①溫度不要過(guò)高；②控制pH值范圍(pH值5-9)；③保持一定離子強(qiáng)度；④減少物理因素對(duì)核酸的機(jī)械剪切力；⑤所用器械和一些試劑需高溫滅菌；⑥提取緩沖液中需加核酸酶抑制劑。細(xì)胞內(nèi)或外來(lái)的各種核酸酶能消化核酸鏈中的磷酸二酯鍵，破壞核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)。

第6章分子生物學(xué)技術(shù)（三）核酸分子抽提的技術(shù)設(shè)計(jì)1、核酸的釋放--破裂細(xì)胞，釋放核酸。⑴高速組織搗碎機(jī)搗碎⑵玻璃勻漿器勻漿⑶超聲波處理法⑷液氮研磨法⑸化學(xué)處理法(SDS、LDS，吐溫80等）⑹生化法（溶菌酶、纖維素酶等）第6章分子生物學(xué)技術(shù)2、核酸的分離與純化將含有核酸分子復(fù)雜復(fù)合物中，將核酸與其他物質(zhì)分離非核酸的大分子污染物（蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子）、非目的核酸分子、試劑3、核酸的濃縮、沉淀與洗滌沉淀可去除部分雜質(zhì)與某些鹽離子加入一定的鹽類（醋酸鈉、氯化鈉等）后使用有機(jī)溶劑（如乙醇、異丙醇等）少數(shù)鹽類可使用70-75%的乙醇洗滌第6章分子生物學(xué)技術(shù)4、核酸的鑒定⑴濃度鑒定濃度大于0.25ug/ml的核酸溶液--紫外分光光度法。DNARNA濃度(μg/ml)=OD260×稀釋倍數(shù)×5040低濃度核酸溶液--溴化乙錠熒光光度法。⑵純度鑒定DNA:OD260/OD280=1.8；OD260/OD230>2.0。RNA:OD260/OD280=1.7-2.0；OD260/OD230>2.0。⑶完整性鑒定--凝膠電泳法第6章分子生物學(xué)技術(shù)5、核酸的儲(chǔ)存DNA：①溶于pH8.0的TE（tris和EDTA）緩沖液中，4℃或-20℃保存；②長(zhǎng)期保存樣品中可加入1滴氯仿。RNA：①溶于0.3mol/LNaAc(pH5.2)或雙蒸滅菌水中，-70℃保存;②溶于70%的乙醇溶液或去離子的甲酰胺溶液中，-20℃保存。或加1滴0.2mol/LVRC(氧釩核糖核苷復(fù)合物)凍貯于-70℃。第6章分子生物學(xué)技術(shù)二、基因組DNA的分離與純化（一）樣品準(zhǔn)備常見的標(biāo)本：血液、尿液、唾液、組織、培養(yǎng)細(xì)胞、細(xì)菌等。生物組織：最好新鮮組織，若不能馬上提取，應(yīng)貯存－70℃或液氮中。第6章分子生物學(xué)技術(shù)（二）DNA提取1、酚抽提法：先用EDTA、SDS、蛋白酶K破碎細(xì)胞，消化蛋白，然后用pH8的Tris飽和酚或酚-氯仿抽提DNA，最后乙醇或異丙醇進(jìn)行沉淀。獲DNA大小為100－150kb。第6章分子生物學(xué)技術(shù)主要試劑及其作用：EDTA：①二價(jià)金屬螯合劑，抑制核酸酶；②降低細(xì)胞膜的穩(wěn)定性。SDS：①溶解膜蛋白和脂肪，使細(xì)胞膜破裂；②溶解核膜和核小體，使其解聚，將核酸釋放出來(lái)；③對(duì)RNA、DNA酶有抑制作用；④與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物，使蛋白質(zhì)變性。第6章分子生物學(xué)技術(shù)蛋白酶K：消化DNA酶和細(xì)胞中的蛋白質(zhì)。可與SDS、EDTA同時(shí)使用，仍保持較高活性。酚：使蛋白質(zhì)變性沉淀，抑制DNA酶活性。pH8.0的Tris溶液：使抽提出的DNA進(jìn)入水相，減少在蛋白質(zhì)層滯留。酚或酚-氯仿中少許的異戊醇：減少氣泡的產(chǎn)生，利于分相，保持分相的穩(wěn)定性。第6章分子生物學(xué)技術(shù)2甲酰胺解聚法：

破碎細(xì)胞同上，然后用高濃度甲酰胺解聚蛋白質(zhì)與DNA的結(jié)合，再透析獲得DNA。高濃度甲酰胺可以裂解蛋白質(zhì)與DNA的復(fù)合物，可以使蛋白質(zhì)變性。減少了酚多次抽提的步驟。

適用于從標(biāo)本中制備高分子量的DNA樣品--可得200kb左右的DNA。第6章分子生物學(xué)技術(shù)3玻璃棒纏繞法：用鹽酸胍裂解細(xì)胞，將裂解物鋪于乙醇上，然后用帶鉤或U型玻璃棒在界面輕攪，DAN沉淀液繞于玻棒。生成DNA約80kb。第6章分子生物學(xué)技術(shù)4異丙醇沉淀法：基本同1法，僅用二倍容積異丙醇替代乙醇，可去除小分子RNA（在異丙醇中可溶狀態(tài)）。第6章分子生物學(xué)技術(shù)5表面活性劑快速制備法：用TritonX-100或NP-40表面活性劑破碎細(xì)胞，然后用蛋白酶K或酚去除蛋白，乙醇沉淀或透析。第6章分子生物學(xué)技術(shù)（三）DNA樣品的純化方法：透析、層析、電泳及選擇性沉淀。瓊脂糖電泳適用于0.1-60Kb片段，聚丙烯酰胺（PAGE）電泳適用于5-500bp大小的片段。瓊脂糖含量％（W/V）線性DNA分離范圍（Kb）0.35-600.61-200.70.8-100.90.5-71.20.4-61.50.2-32.00.1-2第6章分子生物學(xué)技術(shù)（四）DNA的濃縮1、固體聚乙二醇（PEG）濃縮：用透析袋外敷PEG至合適量。2、丁醇抽提濃縮：DNA溶液中水可分配到正丁醇或仲丁醇，但DNA不會(huì)。因此重復(fù)幾次可顯著減少DNA體積。第6章分子生物學(xué)技術(shù)（六）DNA回收主要是從電泳中分離回收DNA片段。回收原則：盡量提高回收率，去除回收DNA樣品中的污染物。電泳到DEAE-纖維素膜：500bp-5kb的DNA片段回收率較好，純度高。但不適用于分子量超過(guò)10kb和單鏈DNA。透析袋電洗脫：低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠：有機(jī)溶劑提取法、玻璃珠洗脫法和瓊脂水解酶等。第6章分子生物學(xué)技術(shù)

核酸分子雜交（nucleicacidhybridization）指具有互補(bǔ)序列的兩條核酸單鏈在一定條件下按堿基配對(duì)原則形成雙鏈的過(guò)程。不同來(lái)源的DNA或RNA單鏈在一定條件下重新組成的新的雙鏈分子——雜交分子。第二節(jié)核酸雜交技術(shù)一、核酸分子雜交的基本原理第6章分子生物學(xué)技術(shù)1、DNA的變性(denaturation)：在某些理化因素的作用下，核酸雙鏈分子堿基對(duì)的氫鍵斷裂，疏水作用被破壞，雙鏈螺旋或發(fā)夾結(jié)構(gòu)被拆開，有規(guī)則的空間結(jié)構(gòu)被破壞，形成單鏈分子的過(guò)程。常用的變性方法：①熱變性；②酸堿變性；③化學(xué)試劑變性第6章分子生物學(xué)技術(shù)2、DNA的復(fù)性（renaturation)：在適當(dāng)條件下，變性DNA的兩條互補(bǔ)鏈可再恢復(fù)成天然的雙螺旋結(jié)構(gòu)的過(guò)程。熱變性的DNA經(jīng)緩慢冷卻后即可復(fù)性，此過(guò)程稱為退火(annealing)。第6章分子生物學(xué)技術(shù)3、解鏈溫度（融解溫度，Tm）

(meltingtemperature)：使50%的DNA發(fā)生變性時(shí)的環(huán)境溫度。第6章分子生物學(xué)技術(shù)增色效應(yīng)：DNA變性后對(duì)260nm紫外光收增加的現(xiàn)象。減色效應(yīng)：變性DNA復(fù)性后對(duì)260nm紫外光吸收減少的現(xiàn)象。第6章分子生物學(xué)技術(shù)單鏈核酸的起始濃度：濃度越高，復(fù)性越快。核酸鏈長(zhǎng)度：越長(zhǎng)，形成配對(duì)的難度越大，復(fù)性也慢。核酸分子的復(fù)雜性：復(fù)雜性越高，形成正確配對(duì)的難度也越大，復(fù)性越慢。影響復(fù)性的因素第6章分子生物學(xué)技術(shù)溫度：溫度過(guò)低則分子運(yùn)動(dòng)減慢，少數(shù)堿基形成的局部雙鏈也不易解離。適宜的復(fù)性溫度是比Tm低25℃。離子強(qiáng)度：適當(dāng)?shù)碾x子強(qiáng)度可中和核酸分子上磷酸基團(tuán)所帶的負(fù)電，減少雙鏈間的靜電斥力，有利于復(fù)性。但離子強(qiáng)度過(guò)高也不利于復(fù)性。Tm值與核酸含量的關(guān)系①<20bpTm=4(G≡C)+2(A＝T)②>20bpTm=69.3+0.41(G≡C)%第6章分子生物學(xué)技術(shù)4、雜交來(lái)源不同的兩條單鏈核酸分子通過(guò)堿基互補(bǔ)形成異源雙螺旋分子，稱為核酸分子雜交。雜交可分成：DNA與DNA、RNA與RNA、DNA與RNA之間的雜交。核酸分子雜交技術(shù)：使已知序列的DNA或RNA片段上帶上可檢測(cè)的標(biāo)記，可用來(lái)檢測(cè)樣品中未知的核酸序列。第6章分子生物學(xué)技術(shù)第6章分子生物學(xué)技術(shù)探針濃度、長(zhǎng)度、復(fù)雜性：探針濃度越高，復(fù)性速度越快。但雙鏈探針濃度過(guò)高會(huì)增加自我復(fù)性而影響雜交；濃度過(guò)高也會(huì)增加非特異結(jié)合，使雜交背景增強(qiáng)。探針越長(zhǎng)擴(kuò)散速度越慢；復(fù)雜性越高，配對(duì)難度也增大。離子強(qiáng)度：高離子強(qiáng)度溶液中，有利于雜交分子形成。影響核酸分子雜交的因素第6章分子生物學(xué)技術(shù)溫度：通常在低于Tm20-25℃的溫度下進(jìn)行雜交。添加劑：硫酸葡聚糖、聚乙二醇、聚丙烯酸可吸附DNA探針，使DNA接觸面增大，而加速雜交反應(yīng)。雜交液中的甲酰胺。甲酰胺可降低核酸雜交的Tm。含30%—50%甲酰胺的雜交溫度能降低到30—42℃。較低的雜交溫度，使探針更穩(wěn)定，并能更好地保留非共價(jià)結(jié)合的核酸。第6章分子生物學(xué)技術(shù)4、預(yù)雜交

為了減少探針與廣泛存在的非互補(bǔ)核酸的非特異性結(jié)合，在雜交前可用封閉物將這些非特異位點(diǎn)封閉。在雜交前的這些處理過(guò)程稱為預(yù)雜交。第6章分子生物學(xué)技術(shù)常用于預(yù)雜交的封閉物變性的非特異性DNA：常用鮭魚精子DNA或小牛胸腺DNA。當(dāng)與濾膜一起孵育后，除濾膜上已吸附樣品DNA的區(qū)域外，它們可被吸附到所有其它區(qū)域，使整個(gè)背景覆蓋一層。由于它們與探針無(wú)同源性，在雜交反應(yīng)中可大大減少探針的非特異性結(jié)合，使背影清晰。高分子化合物：某些高分子化合物具有封閉膜上非特異位點(diǎn)的能力。一般常用Denhard’t溶液，包含聚乙烯吡咯酮、小牛血清白蛋白、聚蔗糖。第6章分子生物學(xué)技術(shù)二、核酸探針指能與特定核酸序列發(fā)生特異性互補(bǔ)的已知核酸片段。一般而言，核酸探針帶有特殊的標(biāo)記物。核酸探針的類型：

寡核苷酸探針、基因組DNA探針、cDNA探針、RNA探針、單鏈DNA探針。常用的探針標(biāo)記物：

放射性同位素（3H、32P、35S、125I）；非放射性同位素（生物素、地高辛、辣根過(guò)氧化酶、堿性磷酸酶等）。第6章分子生物學(xué)技術(shù)三、核酸分子雜交信號(hào)的檢測(cè)放射性同位素標(biāo)記探針：

放射自顯影。非放射性同位素標(biāo)記探針：偶聯(lián)反應(yīng)+顯色反應(yīng)。第6章分子生物學(xué)技術(shù)四、核酸分子雜交技術(shù)固相雜交：結(jié)合于某種固相支持物上的待測(cè)樣品與溶解于雜交液中的探針進(jìn)行的雜交。包括膜上印跡雜交、原位雜交。液相雜交：待測(cè)樣品和探針均溶于液體中進(jìn)行雜交反應(yīng)。第6章分子生物學(xué)技術(shù)（一）膜上印跡雜交

將待測(cè)核酸序列結(jié)合到一定的支持物上，然后與存在于液相中的核酸探針進(jìn)行雜交的過(guò)程稱為膜上印跡雜交。印記的方法：虹吸印跡法；真空轉(zhuǎn)移法；電轉(zhuǎn)移法第6章分子生物學(xué)技術(shù)DNA或RNA↓電泳分離核酸片段↓轉(zhuǎn)移至固相支持物（印跡技術(shù)）↓雜交↓洗去未雜交探針↓雜交信號(hào)檢測(cè)第6章分子生物學(xué)技術(shù)Northern雜交原理：RNA經(jīng)過(guò)變性瓊脂糖凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜或尼龍膜上，經(jīng)過(guò)雜交，分析mRNA的大小及含量。

應(yīng)用：半定量分析mRNA的含量；確定mRNA分子的大小。

方法：提取組織細(xì)胞總RNA→RNA定量→變性膠電泳→轉(zhuǎn)膜→干膜→預(yù)雜交→雜交→洗膜→壓片→洗片→圖像分析第6章分子生物學(xué)技術(shù)Western印跡雜交

將待檢測(cè)蛋白質(zhì)（或酶）經(jīng)PAGE電泳并染色后，轉(zhuǎn)移到濾膜上固定，再用“抗體-抗原”免疫反應(yīng)或“DNA-protein”結(jié)合反應(yīng)鑒別濾膜上的蛋白質(zhì)。斑點(diǎn)印跡雜交和狹線印跡雜交適于核酸樣品定量檢測(cè)。第6章分子生物學(xué)技術(shù)（二）原位雜交

用標(biāo)記的已知核酸序列為探針，使其與細(xì)胞組織或切片中核酸進(jìn)行雜交檢測(cè)的方法稱為原位雜交。原位雜交的類型：DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-RNA雜交。第6章分子生物學(xué)技術(shù)取材↓組織、細(xì)胞固定↓預(yù)雜交↓雜交↓放射自顯影或免疫酶法顯色↓觀察結(jié)果

第6章分子生物學(xué)技術(shù)（三）液相雜交RNA酶保護(hù)分析法核酸酶S1保護(hù)分析法第6章分子生物學(xué)技術(shù)待測(cè)RNA樣品↓液相雜交↓DNA-RNA雜交雙鏈↓酶解↓雜交體系純化↓脲-聚丙烯酰胺凝膠電泳↓放射自顯影

核酸酶S1（專一降解未雜交的DNA和RNA單鏈）←←單鏈DNA探針（M13體系合成）第6章分子生物學(xué)技術(shù)待測(cè)RNA樣品↓液相雜交↓RNA-RNA雜交雙鏈↓酶解↓雜交體系純化↓脲-聚丙烯酰胺凝膠電泳↓放射自顯影

←

單鏈RNA探針RNA酶（專一降解未雜交的RNA單鏈）←第6章分子生物學(xué)技術(shù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：在引物指導(dǎo)下由酶催化的對(duì)特定克隆或基因組DNA序列進(jìn)行的體外擴(kuò)增反應(yīng)。第三節(jié)PCR技術(shù)第6章分子生物學(xué)技術(shù)PCR反應(yīng)的特點(diǎn)特異性強(qiáng)：引物與模板結(jié)合的特異性及聚合酶的忠實(shí)性。靈敏度高：指數(shù)增長(zhǎng)，從pg(10-12)可擴(kuò)增至mg(10-6)水平簡(jiǎn)便、快速：2-4小時(shí)完成擴(kuò)增。對(duì)標(biāo)本的純度要求低：DNA粗制品及總RNA均可作為擴(kuò)增模板。第6章分子生物學(xué)技術(shù)一、PCR反應(yīng)原理和反應(yīng)過(guò)程DNA的體外復(fù)制包括3個(gè)步驟：變性（denaturation）:94

C

~95

C

退火（annealing）:40

C

~70

C

延伸（extension）:72

C

3個(gè)步驟作為PCR的一個(gè)循環(huán)，每當(dāng)完成一個(gè)循環(huán)，一個(gè)分子的模板被復(fù)制為二個(gè)，產(chǎn)物量以指數(shù)形式增長(zhǎng)。第6章分子生物學(xué)技術(shù)二、PCR的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件（一）PCR反應(yīng)體系參與PCR反應(yīng)的主要成份:模板、引物、dNTP、TaqDNA聚合酶和緩沖液等。第6章分子生物學(xué)技術(shù)1、模板（template）包括基因組DNA、RNA、質(zhì)粒DNA、線粒體DNA等。模板DNA需較高的濃度RNA作為模板時(shí)，須先將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以cDNA作為擴(kuò)增的模板。模板量：1000ng、500ng、100ng、50ng

第6章分子生物學(xué)技術(shù)2、引物（Primers)引物是化學(xué)合成的寡核苷酸片段，它決定了PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性和長(zhǎng)度。化學(xué)合成的寡核苷酸能與模板特異地結(jié)合引物決定產(chǎn)物的特異性和長(zhǎng)度引物設(shè)計(jì)時(shí)必須遵循一些原則第6章分子生物學(xué)技術(shù)設(shè)計(jì)引物的原則二條引物分別位于被擴(kuò)增片段的兩端，與模板正負(fù)鏈序列互補(bǔ)。長(zhǎng)度為18-25個(gè)核苷酸。二條引物之間避免形成引物二聚體。引物的堿基組成應(yīng)平衡。引物的5’端可被修飾（引入酶切位點(diǎn)、引入突變位點(diǎn)、生物素等標(biāo)記）引物濃度：0.1~0.2umol/L,濃度過(guò)高容易生成引物二聚體。第6章分子生物學(xué)技術(shù)3、脫氧核苷三磷酸（dNTP）是dATP、dCTP、dGTP和dTTP4種脫氧核苷三磷酸的混合物反應(yīng)體系中各種核苷酸的濃度必須一致。濃度過(guò)高雖能加快反應(yīng)速度，但非特異性擴(kuò)增也隨之增加。dNTP濃度：20~200umol/L,濃度升高增加非特異性擴(kuò)增。第6章分子生物學(xué)技術(shù)4、DNA聚合酶從一種生活在熱泉（80℃~90℃）中的水棲噬熱菌（Thermusaquaticus,Taq）中提取，有很高的熱穩(wěn)定性。Taq酶的作用:在模板指導(dǎo)下，以dNTP為原料，于引物3’-OH末端處加上脫氧單核苷酸，形成3’,5’-磷酸二酯鍵，使DNA鏈沿5’→3’方向延伸，催化DNA合成。最適酶量：1-2.5U

。酶量過(guò)多，導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。第6章分子生物學(xué)技術(shù)5、鎂離子濃度鎂離子濃度對(duì)于Taq酶的活性有直接影響。

PCR反應(yīng)體系中dNTP、引物、模板DNA及鰲合劑的均可與Mg2+結(jié)合，降低游離Mg2+的濃度，從而影響酶的活性。當(dāng)dNTP濃度為200umol/L，MgCl2的濃度為1.5mmol/L時(shí)較適宜。第6章分子生物學(xué)技術(shù)（二）PCR的反應(yīng)條件反應(yīng)溫度（變性、退火、延伸）反應(yīng)時(shí)間（變性、退火、延伸）循環(huán)次數(shù)（PCR效率及產(chǎn)物量）第6章分子生物學(xué)技術(shù)1、溫度變性溫度：94~97℃退火溫度：低于引物Tm

5℃左右溫度過(guò)高--降低擴(kuò)增效率；溫度過(guò)低--增加非特異性擴(kuò)增延伸溫度：72℃，此時(shí)Taq酶具有較高的酶促活性第6章分子生物學(xué)技術(shù)2、時(shí)間第一次變性應(yīng)給予足夠時(shí)間（5~7分鐘）每個(gè)步驟所需時(shí)間取決于擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度，一般為30秒~1分鐘，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。第6章分子生物學(xué)技術(shù)3、循環(huán)次數(shù)重復(fù)次數(shù)一般設(shè)為25~35個(gè)循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)的平臺(tái)效應(yīng)：理論上，PCR反應(yīng)產(chǎn)物呈指數(shù)性增長(zhǎng)，但這種增長(zhǎng)形式在擴(kuò)增25-25個(gè)循環(huán)以后便放慢直至停止，達(dá)到反應(yīng)平臺(tái)，此時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物量不再隨循環(huán)次數(shù)的增加而呈指數(shù)增長(zhǎng)。第6章分子生物學(xué)技術(shù)三、PCR中試劑與樣本的保存1、裂解液

4℃貯存，避免反復(fù)凍融，否則影響裂解效果，造成假陰性。

2、反應(yīng)液

-20℃貯存。試劑開封后，4℃保存在1~2周內(nèi)用完。反應(yīng)液反復(fù)凍融5次影響不大，但過(guò)多的凍融會(huì)降低擴(kuò)增效率。（一）試劑貯存第6章分子生物學(xué)技術(shù)3、Taq酶

-20℃貯存（存于有霜冰箱）。

4、陽(yáng)性模板

-20℃貯存，可反復(fù)凍融5次左右。陽(yáng)性模板4℃也可貯存2周左右。第6章分子生物學(xué)技術(shù)1、尿道、陰道、宮頸分泌物

棉拭子經(jīng)生理鹽水洗滌后，2000r/min后取上清500ul。過(guò)多的沉淀物裂解后，會(huì)導(dǎo)致PCR抑制而產(chǎn)生假陰性結(jié)果，或出現(xiàn)電泳背景模糊和拖尾現(xiàn)象。尤其是膿性分泌物，沉淀物過(guò)多，易造成假陰性。（二）標(biāo)本處理第6章分子生物學(xué)技術(shù)2、尿液

男性尿道炎患者，若無(wú)分泌物，可用初段尿。尿液置冷