結核分枝桿菌耐藥基因的pcrsscp檢測

近年來，抗癲癇藥物（ih）和抗癲癇藥物（pdr-t）的增加，嚴重影響了核電站的化療效果，給核電站的控制帶來了困難。而傳統的結核分枝桿菌培養和藥敏試驗不僅耗時長,在藥物敏感性測定方面也存在一些問題,因此檢測結核分枝桿菌耐藥基因,了解其耐藥情況,對指導治療是一種新探索。作者通過Bactec-960儀快速培養增菌,聚合酶鏈反應-單鏈構像多態性分析(PCR-SSCP)檢測結核分枝桿菌臨床分離株的耐藥基因rPOB、katG和rPSL,聯合藥敏試驗初步分析了臨床應用情況。1材料和方法1.1年齡/年齡以及復治肺結核病選擇的123例病人均為結核科住院病人,痰涂片抗酸染色陽性并有痰培養陽性結果。其中男性84人,年齡(47.45±19.13)歲;女性39人,年齡(43.58±19.25)歲。病程1.2個月～26年,平均1.0年,均為繼發性肺結核,其中輕度42例,中度47例,重度34例。初治肺結核病人37例(入院前均未使用抗結核藥物),復治肺結核病人86例,其中75例治療不規范(化療方案不合理,療程不夠,不規律用藥,單藥調整等)。全部病人留取痰標本,經Bactec-960增菌培養和7H9培養基培養,并按《結核病診斷細菌學檢驗規程》進行菌種鑒定和不同濃度梯度的藥敏試驗。1.2引物系統和培養基結核分枝桿菌rPOB、katG、rPSL基因檢測試劑盒由本院結核病分子生物學實驗室提供;引物系統見文獻;7H9培養基由美國DB公司提供;藥敏試劑本室自配。1.3基因型和藥敏試驗①痰標本前處理后,經Bactec-960儀培養3～7天,部分培養物做藥敏梯度試驗,部分培養物提取DNA。②DNA制備:采用本院結核病研究室自制的試劑盒提取DNA,置—20℃保存備用。③PCR擴增:按試劑盒說明書進行操作,擴增結核分枝桿菌耐RFP基因rPOB產生307bp片段,擴增結核分枝桿菌耐INH基因katG產生245bp片段,擴增結核分枝桿菌耐SM基因rPSL產生267bp片段。耐藥基因完全缺失,PCR可為擴增陰性。④SSCP分析:將引物擴增陽性的基因產物在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳,溴化乙錠染色后照相觀察結果。⑤結果判定:根據凝膠上顯現的不同帶型,通過與野生敏感菌RFP、INH和SM標準株DNA擴增產物對照,即可確定突變基因型。⑥不同藥物濃度梯度為:異煙肼(INH):高濃度10mg/L、低濃度1mg/L;利福平(RFP):高濃度250mg/L、低濃度25mg/L;鏈霉素(SM):高濃度100mg/L、低濃度10mg/L;乙胺丁醇(EB):高濃度50mg/L、低濃度5mg/L;卡那霉素(K):高濃度6mg/L、低濃度0.6mg/L;吡嗪酰胺(PZA):高濃度50mg/L、低濃度5mg/L;氧氟沙星(O):2mg/L;對氨水楊酸(PAS):6mg/L;左旋氧氟沙星(V):高濃度5mg/L、低濃度0.5mg/L。聯合藥敏濃度:異煙肼、利福平(HR):(H1mg/L+R50mg/L);異煙肼、利福平和鏈霉素(HRS):(H1mg/L+R50mg/L+S10mg/L);異煙肼、利福平和乙胺丁醇(HRE):(H1mg/L+R50mg/L+E5mg/L)。2結果2.1復治肺結核病人符合用藥頻率見表1。初治肺結核病人結核分枝桿菌對藥物耐藥頻率自高往低排列是:RFP(8/14),INH(7/14),SM(6/14),PZA(4/14),EB(3/14),K(2/14),O(1/14),PAS(1/14)和左旋氧氟沙星(1/14)。其中RFP高耐3例、低耐5例,INH高耐2例、低耐5例,SM高耐2例、低耐4例,PZA低耐3例、高耐1例,EB高耐1例、低耐2例,K低耐2例,氧氟沙星、PAS和左旋氧氟沙星低耐各1例。復治肺結核病人結核分枝桿菌對藥物耐藥頻率自高往低排列是:INH(68/86),RFP(65/86),EB(59/86),SM(59/86),K(45/86),PZA(44/86),PAS(36/86),O(18/86)和左旋氧氟沙星(16/86)。其中INH高耐47例,低耐21例,RFP高耐53例、低耐12例,EB高耐28例、低耐31例,SM高耐38例、低耐21例,K高耐18例、低耐27例,PZA高耐32例、低耐12例,PAS高耐16例、低耐20例,氧氟沙星高耐3例、低耐15例,左旋氧氟沙星高耐2例、低耐14例。有8例結核分枝桿菌臨床分離株HRE或HRS單藥均耐藥,但聯合藥敏敏感。2.2根桿菌的抗生殖器和抗生殖器之間的關系分析見表2。從表中可以看出利福平、異煙肼和鏈霉素3種耐藥基因突變率隨著耐藥濃度的增高而增加。2.3復治人藥敏和聯合耐藥基因檢測結果選擇資料完整的28例病例進行初步分析。3例初治病人開始使用HRZ治療,2個月痰菌不陰轉,藥敏和聯合耐藥基因檢測發現HR高耐并有耐藥基因突變,改用力克肺疾、左旋氧氟沙星、乙胺丁醇等藥物和免疫調節劑治療,1個月后痰菌陰轉。9例復治病人藥敏和聯合耐藥基因檢測發現HRS高耐,HRS均有耐藥基因突變,停用HRS,改用力克肺疾、氧氟沙星、丙硫異煙肼、丁胺卡那霉素和免疫調節劑等治療,3個月后7例病人痰菌陰轉。4例復治病人藥敏和聯合耐藥基因檢測發現HR其中有1藥低耐,但無耐藥基因突變,堅持HR聯合用藥,并加用O、K、P等藥物及免疫調節劑治療,2個月后痰菌陰轉。3例復治病人藥敏和聯合耐藥基因檢測發現HRS均低耐,S或H有耐藥基因突變,但HRE或HRS聯合藥敏敏感,在HRE或HRS基礎上,加用氧氟沙星、丙硫異煙胺、PAS和免疫調節劑等藥物,3個月后2例痰菌陰轉,1例痰菌量明顯減少。1例復治病人入院治療給于HROEZ,但療效不佳,痰菌持續陽性,藥敏和聯合耐藥基因檢測發現H低耐,R高耐,均有耐藥基因突變,E、Z也耐藥,于是停用HREZ,改用O、P、K、力克肺疾和免疫調節劑等藥物治療,痰菌陰轉。4例復治病人藥敏和聯合耐藥基因檢測發現H、R低耐,均有耐藥基因突變,HR聯合藥敏耐藥,停用HR,改用O、P、K等敏感藥物,2個月后3例痰菌陰轉。4例復治病人藥敏和聯合耐藥基因檢測發現H、R低耐,均有耐藥基因突變,堅持H、R、O、P、Z、K等藥物治療,2例痰菌陰轉。3耐藥基因檢測有關結核分枝桿菌耐藥分子機制的基礎研究已有不少報道,并已闡明了部分結核分枝桿菌的耐藥機制。但臨床標本經Bactec-960快速增菌,將耐藥基因檢測聯合藥敏試驗用于臨床指導治療的文獻很少。研究結果初步表明,利福平、異煙肼和鏈霉素敏感株同樣存在著基因突變,突變率分別為6.2%、10.8%和25.8%,有關文獻也有類似報道。解釋這一現象的可能原因為每一種藥物靶編碼基因突變是逐漸積累的結果。PCR-SSCP很敏感,有很少量耐藥菌也能擴增陽性,而藥物敏感試驗不一定出現耐藥。文獻報道結核分枝桿菌耐利福平、異煙肼和鏈霉素的rPOB、katG和rPSL基因突變率分別為96%～98%、47%～58%和52%～59%。從本結果可以看出,利福平、異煙肼和鏈霉素3種耐藥基因突變率隨著耐藥濃度的增高而增加。本研究結果的rPOB、katG和rPSL耐藥基因突變率分別為60.2%、48.0%和61.5%,而66%的病人為耐多藥結核病人(MDR-TB),基因突變率報道的差異可能與各地區用藥和菌株地區分布差異有關。耐藥基因突變率隨著耐藥濃度增高而增加,表明隨著不規律用藥時間的延長,使突變率增高,耐藥性增強。本文研究結果發現藥敏梯度試驗中部分結核分枝桿菌對利福平、異煙肼和鏈霉素耐藥,但未發現rPOB、katG和rPSL基因突變,提示我們結核分枝桿菌的rPOB、katG和rPSL基因未突變并不意味著沒有其他基因突變,可能存在其他耐藥機制。分析總結臨床資料,發現初治肺結核病人中有1/3的病人對一種以上抗結核藥物耐藥,而且以第一線抗結核藥物為多。這至少說明了由于受到耐藥結核桿菌感染,部分初治肺結核病人未治療前就已經耐藥,如果對這些病人按常規化療方案治療,不做藥敏和耐藥基因檢測,就會影響治療效果。臨床治療中發現一些肺結核病人盡管藥敏試驗提示H、R或S部分低耐或全部低耐,但HRS或HRE敏感,在上述藥物的基礎上加用一些其他敏感藥物和免疫調節劑也取得了較好的治療效果。這可能有兩方面的原因:①藥敏試驗RFP、INH、SM耐藥只能證明病灶菌群中有耐藥菌株存在,但并不全是耐藥菌,如果耐藥菌數量不多,繼續使用RFP、INH效果就比較好;②使用RFP、INH的情況下,耐藥菌活力和毒力可能較弱,強毒力的敏感菌也不易繁殖。臨床初步應用結果表明,將常規藥敏試驗結果和耐藥基因檢測聯合應用,可以起到互補作用,提供較詳盡的結核分枝桿菌耐藥情況,幫助臨床醫生制定合理的化療方案,特別對MDR-TB病人治療指導意義更大。通過有限的臨床資料,可以有以下的初步印象:復治病人如果H、R高耐,而且有基因突變