登革病毒感染檢測技術研究進展

df是由感染瑞登病毒（denv）引起的一種急性感染。根據世界衛生組織（who）的標準，df分為df、dhf和dz）。根據2009年的標準，df被分為四種類型：常規登陸熱、亞重水位熱和重登陸熱。對于重量運動，dhf和pss的主要傳播方式為爬革熱。對于亞洲和美國的嚴重病例，df已發展成為一個日益嚴重的全球公共衛生問題。據統計，2012年df的發病率比前50年高30倍。世界上大約25億人口的健康受到denv感染的威脅，每年約有5000萬人接受新的denv感染。感染denv的非典型癥狀包括登甲炎、登甲炎、肝炎和登甲炎。快速準確的denv檢測技術可以有效控制df的爆發并減少死亡病例。目前DENV感染的檢測技術主要有病毒分離培養、分子生物學診斷及血清學診斷三方面,而血清樣本是常規診斷的首選.本文主要對DENV感染的檢測技術的研究進展進行了綜述.1denv的分離培養在DENV感染發熱期,患者的血清、血漿或白細胞中均可分離出DENV,而采集血液樣本進行DENV的分離培養的最佳時機為發熱第1~5d內.DENV的分離培養可通過活蚊(如:成蚊胸內接種)、蚊蟲細胞(如:白紋伊蚊C6/36細胞株、埃及伊蚊AP-61細胞株、安邦巨蚊TRA-284細胞株等)、哺乳動物細胞(如:Vero、LLC-MK2、BHK-21等)及動物(如:乳鼠顱內接種)進行.活蚊分離培養DENV是最敏感的DENV分離培養的方法.應用蚊蟲細胞接種DENV是近年較常用的方法,其中白紋伊蚊C6/36細胞株應用最廣泛.此法檢測快速、敏感性高、經濟實用,已經成為DENV分離培養的標準技術.接種DENV的細胞受感染后可以通過IFA等技術用DENV特異性單克隆抗體檢測DENV抗原進行病毒鑒定.Roche等經快速離心法用C6/36-HT細胞株分離培養出DENV,所有菌株通過IFA確定為DENV-2.Takasaki等報道了1例訪問尼泊爾后發病的患者用C6/36細胞株從血清樣本中成功分離培養出DENV-2.Rocco等報道了1例巴西的輸入性病例,用C6/36細胞株從血清樣本中成功分離培養出DENV,后經IFA測定特異性單克隆抗體確定為DENV-3.Yamada等用C6/36細胞株從血清樣本中分離培養DENV,結果發病5d內的32例血清樣本有28例陽性,發熱3d內的17例血清樣本全部為陽性,發熱1~2d的14例血清樣本有10例陽性.Teichmann等研究結果顯示,病發后1~5d的13例樣本中9例成功分離培養出DENV,病發后6~10d的13例樣本中2例成功分離培養出DENV.DENV的分離培養是診斷DENV感染的金標準.此診斷方法能夠對感染急性期病例進行診斷,同時還可以鑒別各DENV血清型(DENV-1、DENV-2、DENV-3及DENV-4),但由于此診斷方法相對耗時較多,對實驗室檢測儀器設備條件及操作者的專業技術要求較高,故不適用于DENV的快速診斷.2rt-pcr和rt-pcr檢測denv感染的臨床應用DENV感染可以通過檢測DENV的RNA進行診斷.DENV的分子生物學診斷主要應用于感染急性期的診斷.此方法具有較高的敏感性、特異性和重復性,而且診斷快速、操作簡便.目前,PCR及PCR相關檢測技術已經成為DENV感染診斷的一種常規檢測方法,PCR引物和條件見表1.DENV感染的分子生物學診斷方法主要包括反轉錄-聚合酶鏈反應(reversetranscription-polymerasechainreaction,RT-PCR)、實時熒光定量RT-PCR(real-timefluorescentquantitativeRT-PCR)、巢式RT-PCR(nestedRT-PCR)、轉錄介導的基因擴增技術(transcription-mediatedamplification,TMA)等.RT-PCR是將反轉錄(reversetranscription)和聚合酶鏈式擴增(PCR)相結合,以待檢病毒RNA為模版,在反轉錄酶的作用下經逆轉錄合成cDNA,再以cDNA為模版,利用特異性引物對cDNA進行體外擴增合成目的片段,從而檢測是否為該DENV感染的技術.此方法技術靈敏、操作簡便、用途廣泛,是目前診斷DENV感染最滿意的檢測方法,但應用的關鍵是確保RNA中無RNA酶和基因組DNA的污染.DePaula等研究結果表明血清是RT-PCR診斷DENV感染最好的臨床樣本.Gunesekera等采用基于RT-PCR的液體雜交(reversetranscriptase-polymerasechainreactionbased-liquidhybridization,RT-PCR-LH)技術檢測78例疑似DF患者的急性期血清樣本,其中45(57.7%)例陽性,發熱小于5d的22例患者中11(50%)例陽性,發熱5~15d的50例患者中30(60%)例陽性,研究結果表明RT-PCR-LH檢測DENV早期感染的敏感性高.Hapuqoda等研究證實RT-PCR-LH對于DENV感染的早期診斷的敏感性明顯高于以PCR為基礎的其他類型的試驗、病毒分離培養以及MAC-ELISA等其他檢測方法.Maneekan等研究結果顯示single-tubemultiplexRT-PCR檢測DENV感染的敏感性為96.7%,特異性為96.7%.Grobusch等用RT-PCR檢測26例經血清學診斷確診為DENV感染的患者,結果病發后3d內的4例樣本有3(75%)例陽性,病發后4~7d的19例樣本有15(78.9%)例陽性,病發8d及以后的3例樣本無陽性,結果表明RT-PCR對DENV感染的早期診斷能力較好.2.2實時熒光定量pcr檢測denv感染的有效性實時熒光定量RT-PCR是在PCR反應體系中加入熒光基團,利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程,從而將熒光共振能量傳遞現象、光學技術與常規PCR技術相結合,實現了核酸的精確定量,它在PCR指數擴增期間通過連續檢測熒光信號的強弱來實時測定特異性產物的量,并通過標準曲線對目的基因的初始量進行定量分析.由于實時熒光定量PCR儀自動化程度高,因此比常規PCR儀特異性更強且有效解決了常規PCR的污染問題.常用方法有熒光染料摻入法(SYBRgreen)和探針法(TaqManprobe).DosSantos等用實時熒光定量RT-PCR檢測126例疑似DF患者(其中112例確診為DENV感染)的血清樣本,結果104(92.8%)例陽性,其敏感性高于病毒分離、IgM檢測、傳統RT-PCR.Tan等用實時熒光定量RT-PCR對DF患者血清樣本檢測DENV-3,結果表明此方法的敏感性為95.45%,特異性為100%.Yong等研究結果顯示用real-timeSYBRGreenRT-PCR檢測DENV感染的敏感性為99.09%,特異性為100%.Kong等研究結果顯示用TaqManreal-timeRT-PCR檢測DENV感染的敏感性為89.54%,特異性為91.5%.2.3巢式rt-pcr和tma檢測denv基因表達巢式RT-PCR是一種變異的反轉錄-聚合酶鏈反應,使用兩對(而非一對)PCR引物擴增完整的片段,其中第一對PCR引物擴增片段和普通PCR相似;第二對引物稱為巢式引物(因為他們在第一次PCR擴增片段的內部),結合在第一次PCR產物內部,使得第二次PCR擴增片段短于第一次擴增.巢式RT-PCR的好處在于,如果第一次擴增產生了錯誤片斷,則第二次能在錯誤片段上進行引物配對并且擴增的概率極低.因此,巢式RT-PCR的擴增特異性很強.Chinnawirotpisan等研究表明巢式RT-PCR是檢測DENV感染的一種有效的檢測技術.TMA是一個用噬菌體T7RNA聚合酶和Moloney小鼠白血病病毒逆轉錄酶通過DNA中間體進而產生RNA擴增子的等溫RNA轉錄擴增技術.Mohammed等對16521例獻血樣本用TMA技術檢測DENVRNA,結果12(0.07%)例陽性,其中4例經RT-PCR檢測陽性,3例可分離培養出DENV.Mu觡oz-Jordán等研究發現經TMA技術檢測DENVRNA的敏感性大約是實時RT-PCR技術檢測的10~100倍,結果表明TMA是檢測DENV感染臨床急性期血清樣本DENVRNA的一種高度敏感的方法.3elisa法檢測denv感染的鑒定及其診斷意義DENV感染的血清學診斷方法主要包括酶聯免疫吸附試驗(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)、血凝抑制試驗(hemagglutinationinhibitiontest,HIT)、間接免疫熒光法(indirectimmunofluorescenceassay,IFA)、免疫層析法(immunochromatography,ICT)、免疫印跡法(immunoblottest,IBT)、中和試驗(neutralizationtestNT)等.其中最常用的是ELISA和HIT.此方法操作簡便、快速、敏感、標本采集時間限制較小,由于檢測抗體(如:IgM、IgG)要在病發第5d后出現故不適用于早期DENV感染的快速診斷,DENV感染后早期診斷可通過測定NS1(non-structuraprotein1)抗原進行.血清學診斷是DENV感染應用最廣泛的常規檢測技術,而且可以區分初次感染與二次感染初次感染:在發熱開始后第5~6d時IgM抗體升高,第7~10d后IgG也緩慢升高,主要為IgM升高;二次感染:IgM通常低于初次感染,但IgG在發熱后急性期1~2d迅速升高,而且甚至會在接下來的兩周持續升高.ELISA是指將可溶性的抗原或抗體吸附到聚苯乙烯等固相載體上,進行免疫反應的定性和定量方法.ELISA是一種檢測病毒抗原特異性抗體較為流行的方法,此方法具有較高的敏感性和特異性而且操作簡便,對技術設備要求不高,是血清學診斷技術中應用最廣泛的檢測方法.其中應用最廣泛的是IgM捕獲ELISA法(IgMcaptureenzymelinkedimmunosorbentassay,MAC-ELISA)此法的敏感性為83.9%~98.4%,特異性為100%但此法通常會出現10%的假陰性和1.7%的假陽性.Gupta等用DENVNS1抗原捕獲ELISA法檢測2010~2011年印度新德里75份DENV感染急性期病人血清樣本,結果顯示19份(25.3%)DENVNS1抗原陽性.Vazquez等用DF抗體檢測試劑盒(Panbio)對373例血清樣本進行IgM和IgG捕獲ELISA法檢測DENV感染,結果顯示敏感性為96.8%,特異性為99.4%,而且有95.5%的高度一致性區分初次感染與二次感染.deSouza等用3種基于ELISA的檢測技術檢測DENV感染急性恢復期患者的血清樣本(初次感染46例,二次感染33例)以鑒別初次感染與二次感染,結果顯示IgG抗體親和力試驗的特異性為97.8%,陽性率為93.7%;IgM/IgG抗體比試驗的特異性為95.7%,陽性率為88.2%;IgG抗體效價試驗的特異性為97.8%,陽性率為93.7%.Kumarasamy等用DENVNS1抗原捕獲ELISA檢測213例DENV感染急性期血清樣本,結果顯示199(93.4%)例DENVNS1抗原陽性.應用HIT檢測DENV感染是用標準DENV測定血清中的相應抗體或用特異性抗體檢測待檢的血凝性病毒是否為DENV.單份血清血凝抑制試驗效價超過1∶1280者有診斷意義,雙份血清恢復期抗體效價比急性期高4倍以上者可以確診.此方法的優點是操作簡便,靈敏度高,而且可以區分初次感染與二次感染;它的主要缺點是缺乏特異性.初次感染DENV,急性期抗體效價高于1∶10,恢復期抗體效價低于1∶1640;二次感染DENV,第一天抗體效價高于5∶120,急性期和恢復期初期抗體效價大于或等于1∶1280.Hiscox等對2007~2008年老撾人民民主共和國甘蒙省黃病毒流行期1708份血漿樣本用黃病毒抗原DENV-1、DENV-2、JEV進行HIT檢測,結果22(1.3%)例DENV陽性,519(30.4%)例DENV和JEV交叉反應陽性.Anantapreecha等研究結果表明DENV血凝抑制抗體存在交叉反應,故用HIT診斷DENV感染時應考慮交叉反應的影響.IFA是將待檢細胞首先用未標記的抗體處理,使之與特異的抗原形成復合物,然后再用抗抗體的熒光標記抗體著色,即可檢測出特異抗原在細胞中的存在部位,具有熒光增強效應.Ange等用IFA檢測438只印度拉賈斯坦邦DF流行區的成年埃及伊蚊,結果78(15.6%)陽性.Niedrig等研究證實用IFA檢測DENV感染有高敏感性和特異性.ICT是將特異的抗體先固定于硝酸纖維素膜的某一區帶,當該干燥的硝酸纖維素一端浸入樣品(尿液或血清)后,由于毛細管作用,樣品將沿著該膜向前移動,當移動至固定有抗體的區域時樣品中相應的抗原即與該抗體發生特異性結合若用免疫膠體金或免疫酶染色可使該區域顯示一定的顏色,從而實現特異性的免疫診斷.此法是近幾年來國外興起的一種快速診斷技術.Blacksell等研究結果表明用ICT檢測DENV感染的敏感度雖然只有66%~71%,但是ICT檢測DENV感染的一個特性是可以區分初次DENV感染與二次DENV感染.Martínez-Vega等用ICT檢測DENV感染急性期血清樣本的敏感性為52.2%,特異性為84.8%;恢復期血清樣本的敏感性為76.1%,特異性為75.8%.Kidwai等用ICT檢測經WHO標準已確診為DENV感染的559例樣本,結果251(41.9%)例DENV陽性.IBT是指將要檢測的抗原吸印轉移到膜上,再用能與其特異性結合的抗體檢測其存在.它是在蛋白質電泳分離和抗原抗體檢測的基礎上發展起來的一項檢測蛋白質的技術.IBT將SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)的高分辨力與抗原抗體反應的高特異性相結合,此方法敏感度高、特異性強,可用于DENV感染的檢測.Ludolfs等用IBT檢測142例DENV感染急性期病人血清樣本及85例DENV抗體陰性的健康個體血清樣本,結果顯示敏感度為89.4%,特異性為96.5%.應用NT檢測DENV感染是應用抗體使DENV的毒性或傳染性中和的試驗.可用抗體交叉反應或特異性單克隆抗體進行實驗.此方法的優點是敏感性及特異性高;缺點是試驗成本高,耗時長,對實驗者技術要求高.NT主要是檢測初次感染DENV的方法,對于二次感染診斷的可靠性較低.其中空斑減少中和試驗(plaque-reductionneutralizationtest,PRNT)是檢測中和抗體最常用的試驗,與其他中和抗體檢測技術相比,PRNT被看作實驗室中和抗體檢測標準.此外,血清學診斷還有補體結合試驗(complementfixationtest,CFT)等方法.目前新研究出的診斷方法還有通過非侵入性樣本進行DENV特異性抗體IgM、IgG以及NS1抗原的檢測,如:口腔拭子和干血滴(driedbloodspots,DBS).Anders等研究結果表明DENV感染急性期患者的口腔拭子檢測敏感性低于血液檢測,但特異性強,可能替代靜脈血難以收集的患者進行DENV感染的檢測;而DBS檢測同時具有較高的敏感性及特異性.4診斷方法的選擇DENV感染可以分為兩個階段:第一階段,即發熱和病毒血癥期,血液中可檢測到病毒和NS1抗原;第二階段,即發熱期過后4~5d,體內產生大量的IgG和IgM抗體.DENV感染診斷的敏感性大小主要取決于樣本采集的時段.第一階段的臨床診斷主要采集患者的血液樣本進行病毒分離培養和分子生物學檢測,從而獲得較高的陽性率提高檢測的準確性;第二階段的臨床診斷主要采集患者的血清樣本進行血清學檢測為首選,此法可獲得較高的陽性率.DENV感染主要檢測方法各有優缺點,茲簡要總結如下:病毒分離培養快速靈敏、經濟