臨床微生物學檢驗與抗菌藥物敏感性試驗進展

主要學習內容要求基本概念細菌的耐藥性檢測臨床常見的耐藥菌株掌握

IFI的實驗診斷方法及臨床意義熟悉了解標本的采集方法返回上一頁下一頁本章主要學習內容和要求

第一節概述一、現代感染性疾病的特點（一）一般實驗室檢查1.血常規檢查2.C反應蛋白(CRP)3.降鈣素原(PCT),是嚴重細菌性炎癥和真菌感染的特異性指標.（二）病原學實驗診斷感染性疾病的病原體的實驗診斷方法包括病原體的分離培養、病原體特異性抗原抗體的檢測、病原體核酸檢測等多種方法。二、感染性疾病的實驗診斷方法第二節細菌感染的實驗診斷一、標本的采集與培養方法（一）標本采集原則：1.采集標本時應無菌操作。2.應選擇感染部位或病變明顯的部位采集標本。3.選擇在最佳時間采集適宜標本。4.盡量在抗生素使用前采集。5.標本采集后應及時送檢。（二）常用標本的采集及培養方法血液腦脊液與其他無菌體液尿液呼吸道標本糞便泌尿生殖道標本創傷、組織和膿腫標本二.細菌感染的常用病原學檢測

直接顯微鏡檢查病原體分離、培養和鑒定病原體抗原檢測病原體核酸檢測病原體抗體檢測細菌毒素檢測直接顯微鏡檢查

TheGramStainTheGramStainCryptococcusneoformans(indiainkstain)ThecapsuleoftheyeastresistscolorizationbytheIndiaink,resultinginclearorganismsagainstdarkbackgroundM.Tuberculosis(acidfaststain)病原體分離、培養和鑒定MediaBloodagarSelectionmediaMacconkey’sagar鑒定程序菌落形態革蘭染色生化特性S.pneumoniaethemostcommoncauseofbacterialpneumonia;attackspatientswithweakenedrespiratorydefenses;oxidase124第三節細菌的耐藥性檢測一、細菌耐藥性的概念細菌耐藥性(drugresistance):是指細菌對某抗菌藥物的相對抵抗性。指病原體對反復應用的化學治療藥物敏感性降低或消失的現象。第三節細菌的耐藥性檢測二、細菌耐藥性的遺傳機制

天然耐藥性與抗菌藥物無關，是細菌固有的，在某種抗菌藥物發現或產生之前所分離的細菌已對該藥已具有耐藥性。獲得性耐藥A染色體介導的耐藥—

突變B質粒介導的耐藥—

轉導、轉化、接合、易位細菌耐藥性

染色體染色體耐藥性

-穩定

-垂直傳播

-無水平傳播

(耐藥性不會從一種細菌傳給另一種細菌)

細菌耐藥性

質粒質粒的耐藥性不穩定,由于抗生素的使用選擇了耐藥質粒-耐藥基因由一個細菌傳給另一個細菌,甚至是不同的細菌細菌產生耐藥的因素

人的行為使微生物—

適應生存，產生新的防御力抗菌藥物是醫院中各類藥物使用范圍最廣；使用頻度最高；使用量最大的藥物

抗菌藥物的大量使用和不合理使用使微生物產生耐藥性

多重耐藥菌在全世界播散，使抗微生物化療失去效力，以致我們的治療可能又回到了抗菌藥物誕生之前的時代ScreeneddrugresistantstrainbySelectivepressure第三節細菌的耐藥性檢測三、抗生素的耐藥機制膜通透性的降低改變作用靶位分泌各種酶主動外排第三節細菌的耐藥性檢測五、抗生素敏感試驗（一）概念最小抑菌濃度（MICminimalinhibitoryconcentration）:能夠抑制細菌生長的最小抗生素濃度。最小殺菌濃度（MBCminimalbactericidalconcentration）能夠殺死99.9%的細菌的最小抗生素濃度。（二）試驗方法DilutionSusceptibilityTestsBrothdilutionAgardilutionAutomatedbrothmicrodilutionDiskdiffusionEtestScreeningPlatesMolecular(latexagglutination,NAAT)LaboratorystandardsNCCLS(changedtoCLSIinJan2005)AntibacterialAntibioticsβ-lactamantibioticsPenicillinCephalosporinsMonobactamsCarbapenemsOthersGlycopeptideAminoglycosideMacrolidesClindamycinTetracyclineQuinoloneTrimethoprim-sulfamethoxazoleMetronidazole常用抗菌藥物的選擇與分組BrothdilutiontestTubedilutiontestfordeterminingtheminimuminhibitoryconcentration(MIC).AgarDilutionPenicillin1mg/L2mg/L4mg/LMIC=4mg/LBrothMicrodilutionTestingBrothMicrodilutionTestingDiskdiffusiontestE-testanddiskdiffusion藥敏試驗結果的表示及臨床意義SIRBreakpointMICbreakpointsbasedonstudiesassessing:–PK/PDbasedonsystemicantibioticdelivery–Clinicalefficacystudies?Clinicalresistancevs.biologicresistance第三節細菌的耐藥性檢測六、臨床常見的耐藥菌株耐甲氧西林的葡萄球菌（MRS）耐青霉素的肺炎鏈球菌耐萬古霉素的腸球菌耐萬古霉素的金黃色葡萄球菌產ESBLs的革蘭氏陰性桿菌高產AmpC酶的革蘭氏陰性桿菌泛耐藥的銅綠假單胞菌及鮑曼不動桿菌產NDM-1的超級細菌金黃色葡萄球菌青霉素耐藥金葡菌甲氧西林耐藥金葡菌(MRSA)mecAPenicillinMethicillin萬古霉素耐藥屎腸球菌(VRE)vanA萬古霉素（糖肽類）中介/耐藥金葡菌（VISA、GISA）萬古霉素耐藥金葡菌（VRSA）Vancomycin[1940][1960s][1990s][1996][2002]葡萄球菌耐藥性發展歷程抗感染治療什么是MRSA?耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌1961年英國首次報道1968年美國報道MRSA的發生率

40ThICAAC5大洲33個國家的調查

2%-80%中日聯誼醫院金黃色葡萄球菌的分離趨勢MRSA的危害致病性強 臨床常見的病原菌及引起院內感染的重要致病菌.治療手段單一傳染性 常引起暴發的集團感染MRSA的傳播存在于健康人的皮膚,鼻咽等部位.機體免疫力低下及各種插管診斷治療時引起感染通過與他人接觸引起感染MRSA的耐藥機制作用靶位發生改變

mec-A基因------PBP2aMRSA的耐藥特性對所有β內酰胺類藥物均耐藥(包括青霉素,頭孢菌素,碳青霉烯類)MRSA的檢測常規的紙片擴散法oxacillin6ug/ml平板篩選法PCR法檢測MecA基因MRSA治療萬古霉素替考拉寧利奈唑胺Vancomycin-ResistantStaphylococcusaureus

VISA,Japan,1996,MIC8ug/ml2002年6月前，美國8株VISA。2002年6月，第一株VRSA，美國Michigan重要的革蘭陰性耐藥菌腸桿菌屬產ESBLs的腸桿菌產碳青霉烯酶的腸桿菌非發酵菌多重耐藥銅綠假單胞菌多重耐藥鮑曼不動桿菌碳青霉烯酶ESBLs基本概念及耐藥性特點K.pneumoniae和E..coli由Tem-1，Tem-2，SHV-1編碼β內酰胺酶的基因突變而來，由質粒介導，并傳播。體外對三代頭孢菌素和氨曲南抑菌環減小。加克拉維酸抑菌環擴大。對所有的青霉素類，頭孢菌素及氨曲南耐藥。對碳氫酶烯類（泰能）、頭霉素類（頭孢西丁）及克拉維酸敏感。ESBLs 歷史1983年德國首次報道產ESBL的臭鼻克雷伯菌Shv-21985年法國暴發流行產ESBL的肺炎克雷伯菌隨后，德國，英國等國家相繼暴發流行產ESBL的肺炎克雷伯菌，大腸埃希菌。ESBLs的檢測紙片擴散法MIC法雙紙片協同法2013中日4658株病原菌分布中日分離大腸埃希菌耐藥率（680株）中日肺炎克雷伯菌耐藥率（596株）中日銅綠假單胞菌耐藥率（458株）中日金黃色葡萄球菌耐藥率（330株）中日鮑曼不動桿菌耐藥率（301株）選擇抗感染治療方案時應該考慮的因素經驗治療感染的類型可能的病原菌當地細菌感染的流行病學資料藥效學目標治療明確了病源菌獲得了抗生素敏感性實驗結果應用PK/PD參數，制定合理的治療方案考慮病人生理和病理生理狀態其它因素評估病原體評估耐藥性應用PK/PD理論合理優化抗感染治療方案TimekillcurvesforPseudomonasaeruginosaATCC27853withexposuretotobramycin,ciprofloxacin,andticarcillinatconcentrationsfromonefourthto64timestheminimuminhibitoryconcentration.(FromCraigWA,EbertSC.Killingandregrowthofbacteriainvitro:Areview.ScandJInfectDis.1991;74:63–70.)

AntimicrobialPK+MIC+Outcome‘（μg/mL）CmaxMICTimeabove

MICCmax/

MICratio24hAUC/

MICratioAUCMIC=minimuminhibitoryconcentrationAUC=areaundertheconcentrationcurvePK

/PD參數Time>

MIC/用藥間隔24824ｈｏｕｒ16細菌數量

不合理的給藥次數對治療的影響‘（μg/mL）MIC24824ｈｏｕｒ16細菌數量常用抗生素的PK/PD參數如何應用PK/PD參數優化治療方案時間依賴性抗生素可通過增加給藥次數、延長點滴時間甚至持續給藥以達到治療目標靶值。濃度依賴性抗生素可通過提高血藥濃度已達到目標靶值。如何應對這些耐藥細菌？抗生素的合理應用原則只能用于治療感染性疾病盡早確立病原菌診斷針對性經驗治療結合臨床評價細菌培養與藥敏結果的意義選用作用強，在感染部位濃度高的抗生素要有合理的治療終點或療程要重視必要的綜合治療指征明確才能聯合使用抗生素抗生素的聯合應用目的：

產生“協同”或“相加”，減少患者不良反應，減少細菌耐藥性。適宜的種類：繁殖期殺菌劑（β-內酰胺類）與靜止期殺菌劑（氨基糖苷類）。

β-內酰胺類+大環內酯類？抗生素的聯合應用能夠提高初始治療的準確率，從而增加療效。MRSA治療萬古霉素VISAVRSAhVISAVancomycinMICcreep利奈唑胺耐藥？適應癥替加環素產ESBLs的腸桿菌的治療碳青霉烯類抗生素含酶抑制劑的

內酰胺類抗生素其他碳青霉烯耐藥的銅綠假單胞菌治療

含酶抑制劑的

內酰胺類抗生素氨基糖苷類喹諾酮類頭孢他啶、頭孢吡肟聯合碳青霉烯耐藥的鮑曼不動桿菌的治療

含舒巴坦的

內酰胺類抗生素替加環素氨基糖苷類喹諾酮類聯合第四節侵襲性真菌病的實驗診斷一、真菌感染的類型

淺表真菌病皮下真菌病全身性或侵襲性真菌感染醫學真菌分類醫學真菌酵母菌霉菌皮膚癬菌雙相真菌重要醫學酵母菌分類條件致病酵母菌念珠菌屬非念珠菌屬白念珠菌非白念珠菌隱球菌屬毛孢子菌屬克柔念珠菌光滑念珠菌其它念珠菌熱帶念珠菌近平滑念珠菌季也蒙念珠菌葡萄牙念珠菌酵母屬紅酵母屬酵母屬紅酵母屬醫學重要的霉菌分類霉菌曲霉屬非曲霉屬煙曲霉非煙曲霉黃曲霉黑曲霉土曲霉構巢曲霉鐮刀菌屬暗色孢霉賽多孢屬接合菌鏈格孢霉屬雙極菌屬萬氏霉屬彎孢屬茄病鐮刀菌尖孢鐮刀菌尖端賽多孢多育賽多孢根霉屬毛霉屬根毛霉屬梨頭霉屬小克銀漢霉屬煙曲霉黃曲霉黑曲霉土曲霉構巢曲霉侵襲性真菌感染的高危人群侵襲性真菌感染高危因素念珠菌感染*1曲霉感染*2嚴重粒細胞缺乏免疫功能低下移植入住ICU住院時間延長糖尿病腎功能衰竭血液透析使用廣譜抗生素中心靜脈插管嚴重粒細胞缺乏免疫功能低下實體器官移植入住ICU血液腫瘤骨髓移植長期應用激素治療慢性阻塞性肺病(COPD)*念珠菌感染高危因素還包括：胃腸外營養、使用免疫抑制劑、腫瘤和化療、急性重癥胰腺炎、多部位念珠菌定植、外科手術等；曲霉感染高危因素還包括：實體器官腫瘤、HIV感染、重度燒傷、免疫抑制劑治療、營養不良等。1、Sotrosky-ZeichnerLetal.CritCareMed.2006;34:857-863.2、MeerssemanWetal.ClinInfectDis.2007;45:205-16.中性粒細胞缺乏易導致患者發生侵襲性真菌感染(25/82)(57/82)尸檢檢出真菌感染的患者中，嚴重中性粒細胞減少患者占70%一項三級腫瘤監護中心1989年至2003年期間1017例血液腫瘤患者的尸檢結果，其中314例患者發生生侵襲性真菌感染。上圖為1999年至2003年的數據。3、ChamilosGetal.Haematological.2006;91:986-989.曲霉病診斷癥狀體征—特異性？影像學—特異性？真菌涂片—特異！敏感性？真菌培養—敏感性？特異性？時間3~5d病理—特異！敏感性？有創早期、快速、敏感、特異、無創2008年IDSA曲霉病治療指南指出

多種方法用于診斷曲霉感染診斷方法特點優勢劣勢培養可明確區分曲霉和其它絲狀真菌血培養作用有限，某些播散性感染常常為假陽性全身使用抗真菌治療或其它原因易導致假陰性細胞學檢查、組織病理學檢查可獲取明確的曲霉病診斷證據需侵入性手段獲取標本全身使用抗真菌治療或其它原因易導致假陰性CT檢查暈輪征、空氣-新月征等有助于早期診斷其它某些真菌或細菌感染也有可能出現相似征象在免疫正常宿主相關研究較少GM試驗是診斷侵襲性曲霉病的替代指標是建立早期診斷的有效輔助檢查，尤其適用于存在高危因素患者的篩查時有一定假陽性G試驗可早期檢出侵襲性真菌感染對曲霉不具特異性有一定假陽性PCR檢測有較好的前景目前方法尚未標準化，尚在研究階段聯合GM檢測與CT檢查提高侵襲性肺曲霉病的檢出率可提示早期開始抗真菌治療的時機——14、WalshTJetal.ClinInfectDis.2008;46:327-60.侵襲性真菌感染的實驗室檢查(1→3)-β-d-葡聚糖：G試驗曲霉半乳甘露聚糖：GM試驗GM可作為IFI早期診斷的指標GMsensitivity90.6%(48/53)Beforeradiologicsigns64.6%(31/48),?8.4days.Beforeclinicalsymptoms39.6%(18/48),?6.9days.GMspecificityof94%(700/744）AnnieSulahian,etal.CANCER,2001,91:311JID2004:190641GM可否作為療效評估的指標？JID2004:190641GM與預后PenackO,etal.AnnalsofOncology.2008,19:984.GM試驗假陽性抗菌藥物：哌拉西林-三唑巴坦采樣：用藥前，或在血藥濃度較低時高劑量使用激素透析：不能清除大分子GM化療的嚴重黏膜炎的患者谷類食物中的GM抗原通過腸道入血兒童和新生兒：假陽性83%母乳或配方食品中雙歧桿菌與GM有交叉反應交叉反應真菌：青霉、擬青霉、隱球菌、頭狀地霉等Atotalof135serumsampleswerecollectedfrom15patients.Whenacut-offlevelof>0.7wasusedforGMpositivity,therewerenofalsepositiveresults.Whenacutofflevelof<0.5wasused,sixserumsampleswerepositive.TherewerenostatisticallysignificantdifferencesbetweenthemedianGMindicesormedianBDGlevelsofthevarioussamplingtimes.Nosignificantinteractionwasobservedbetweenpiperacillin/tazobactamadministrationandAspergillusGMandBDGassays.GM試驗假陰性抗真菌藥物三唑類－降低GM水平但：棘白菌素類－升高GM水平（能夠破壞真菌細胞壁，但不能清除）低侵襲性曲霉病低曲霉負荷量G試驗底物：(1→3)-β-D-葡聚糖真菌細胞壁成分念珠菌、毛孢子菌、曲霉、鐮刀菌、支頂孢屬、卡氏肺孢子菌除外隱球菌、結合菌綱真菌（根霉、毛霉、根毛霉、犁頭霉等）高特異性、高NPVG試驗Usingacut-offof20pgml,37of41episodesofprovenfungalinfectionshadpositiveresults(sensitivityof90%)andallof59episodesofnon-fungalorigintestednegative(specificityof100%).Of456autopsies,54(11.8%)IFIleukemias:28cases[52%]malignantlymphomas:7[13%]acquiredimmunodeficiencysyndrome:7[13%]solidmalignancies:6[11%]andautoimmunediseases:6[11%]Aspergillusspecies:38cases[70%],Pneumocystisjiroveci:7[13%]Candidaspecies:4[7%]Cryptococcusneoformans:3[6%]Tricho