常見小眼書虱表皮成分的提取

將虱子屬于將虱子屬于將唾液腺并將其劃分為兩個唾液腺。它是目前倉庫中最重要的害蟲，來自印度尼西亞，現在是世界各國。儲糧書虱個體微小,多年來被人們認為是一類以腐肉為食的動物,其尸體為霉菌所食,沒有多大經濟意義而被忽視這種觀點直到20世紀初才被糾正書虱屬昆蟲通常大量發生在水分含量高、有霉菌污染的儲藏物中,可取食包括小麥、大麥、高粱、玉米、稻谷、大豆、木薯、圖書資料、生物標本在內的多種儲藏物品。在中國發生的與儲糧有關的書虱包括嗜卷書虱Liposcelis.bostrychophilaBadonnel嗜蟲書虱L.entomophila(Enderlein)、小眼書虱L.paetaPearman、無色書虱L.decolor(Pearman)、暗褐書虱L.brunneaMotschulsky、皮氏書虱L.pearmaniLienhard、擬蟲書虱L.entomophilaoidea、紅書虱L.rufaBroadhead等,書虱對儲糧品質的影響主要表現在:一是該類昆蟲本身的取食儲糧的危害作用;二是以其尸體、排泄物、蛻下的皮殼和身體碎片污染糧食及其它儲藏物品;三是書虱有可能傳播一些病原菌;四是書虱大量發生時有往往造成儲糧水分升高、溫度上升乃至發生霉變,已經成為近30年來世界糧食儲藏行業的一大問題。近年來,儲糧害蟲防治過度依賴化學藥劑,書虱害蟲對殺蟲劑的抗藥性越來越嚴重,書虱防治難的問題越來越突出,危害愈發嚴重。我國儲糧中發生的書虱主要是嗜蟲書虱、無色書虱、小眼書虱、虛偽書虱等四種。由于儲糧書虱個體小,種類鑒別具有相當的難度,因此,本研究通過分析小眼書虱體表蠟層和護蠟層所含脂類成分,為利用這些成分開展書虱種類鑒別提供新方法,以解決書虱種類鑒別難問題。1材料和方法1.1材料表面1.1.1南南合家由糧食儲備庫小眼書虱L.paetaPearman,來自于河南省南陽市國家糧食儲備庫。培養于河南工業大學糧油食品學院的農業昆蟲與害蟲防治實驗室,該品系已經實驗室純化培養數十代。1.1.2試蟲飼料的配制與制作將過80目篩的全麥粉、脫脂奶粉、酵母以1∶1∶1的比例配制成試蟲飼料,經過高溫消毒后置于(25±1)℃、75%RH環境下平衡2周待用。1.1.3儀器與試劑超聲波振蕩器(工作頻率40kHz);雙道秒表(PC2000A);氣相色譜-質譜聯用儀(AglientTechnologies6890NnetworkGCSystem;Aglienttechnologies5873inentMassSelectiveDetector)。正己烷:色譜純,純度大于99.5%,天津市西華特種試劑廠生產。1.2方法1.2.1寄生蟲試驗培養小眼書虱參照曹陽等的方法。1.2.2生成的層壓裝置用小毛筆選取蟲齡為25～28d小眼書虱500頭,置于潔凈的、由不同大小培養皿組成三層“塔”形裝置上,每層培養皿的表面鋪有與培養皿直徑相當的、潔凈定性濾紙,使位于塔形裝置頂部的書虱自上而下爬行到“塔”底部,收集在底部的書虱于潔凈的培養皿中,保存試蟲在-20℃的冰箱中待用。1.2.3超聲波提取試蟲將按上述條件獲取的500頭小眼書虱置于潔凈的帶有磨口塞的10mL試管中,將直徑略大于試管直徑的圓形定性濾紙放于裝小眼書虱試管中部,然后迅速加入10mL色譜純級(純度≥99.5%)的正己烷,同時保持加有濾紙的試管試蟲不漂浮于濾紙之上,蓋好磨口塞后,將試管連同外形尺寸小于超聲波清洗器容積的試管架一同立即浸在水溫(25±1)℃、水體積剛好浸沒試管的10mL刻度線的超聲波清洗器內,開啟超聲波清洗器進行超聲波振蕩,同時利用秒表計時,設定提取時間為1min,提取完畢后立即取出試管并分離出被提取試蟲,將提取液留于試管中,將提取液在0℃溫度以下密封、避光保存。1.2.3汽化室、溫度和流速上述方法處理的正己烷提取溶液10mL,采用高純N2(≥99.9%)吹掃干燥至2mL,取1μL進樣。采用HP-5的毛細管色譜柱,規格為30.0m×250μm×0.25μm,采用程序升溫的方式,汽化室為280℃,初始箱溫50℃,平衡5min,以10℃/min的速度連續升溫到280℃,然后保持5min;氦氣壓力為7.49psi,流速為1.0mL/min,平均流速為36cm/s;在電子轟擊能量為70eV的電子電離源EI,離子溫度200℃,離子掃描范圍m/z=35～600的條件下,進行MS分析。1.2.4創建平臺的檢索成分分析根據GC/MS聯用所得質譜信息經計算機自帶的NIST(NationalInstituteofStandardsandTechnology)V1.0.0.13MS數據庫檢索,即AutomaticMassSpectralDeconvolutionandIdentificationSystem(AMDIS);化合物的相對含量分析采用GC/MS的自身配置軟件進行計算和MicrosoftOfficeExcel2003軟件進行分析。2結果與分析2.1正己烷溶劑對書績效的提取物組成的影響進行氣相色譜-質譜聯用分析,在儀器檢測限內溶劑本身含有物質將對試驗分析產生干擾,因此在相同試驗條件下,進行正己烷溶劑與書虱表皮的正己烷提取物試驗結果進行對比,分析小眼書虱表皮的提取物組分,如圖1示。小眼書虱表皮物質流出物主要集中在10.072～31.118min之間,共含有18個組分。2.2乙基支鏈及正十九醇組分進行質譜圖檢索和解析后,表皮提取物的結構鑒定得知(見表1),有醇、烴、脂肪酸和酯類四類。第一類醇類物質占2個組分,出峰位置在RT=10.07min、26.92min,分別含有較強的離子碎片峰m/z為57、70、83、98、112及57、69、83、97、111、264及282,解析為含有乙基支鏈的己醇、正十九醇,相對含量分別為6.22%和10.96%;第二類烴類物質占1個組分,出峰位置在RT=15.97min,較強的離子碎片峰m/z為43、57、70、83、98、112,解析為正十四烷,相對含量1.32%;第三類脂肪酸占1個組分,出峰位置在RT=28.31min,較強的離子碎片峰m/z為55、73、83、97、111、129、149、207、256、281,解析為順-6-正十八酸,相對含量為10.14%;第四類酯類物質占14個組分,是表皮提取物的主要成分,總酯類物質的相對含量為88.08%。2.3小眼書保酯類物質的組成及含量甲醇酯類物質出峰位置為21.81、22.00、23.65、27.50、28.42和31.12min,解析的物質依次為順-9-己烯酸甲酯(較強離子峰m/z為55、88、101、157、211、256),14-甲基-正十六酸甲酯(較強離子峰m/z為55、69、83、97、111、152、194、236),順,順-9,12-十八碳二烯酸甲酯(較強離子峰m/z為55、88、101、157、241、284),反-11-正十八碳一烯酸甲酯(較強離子峰m/z為55、73、83、97、111、129、185、207、256、281),反-8-正十八酸甲酯(較強離子峰m/z為55、73、83、97、111、131、207、256、281),1,2,4-苯三甲酸-(4-正十二醇酯)-1,2-二甲酯(較強離子峰m/z為55、83、97、111、129、207、256、264、281)。甲醇酯類物質的相對總含量為35.01%,其中反-8-正十八一烯酸甲酯為總甲醇酯的58.92%,反-11-正十八碳一烯酸甲酯為總甲醇酯的26.96%,十八碳酸甲酯達到了總甲醇酯類物質的85.88%以上。乙醇酯類物質出峰位置為20.64、22.48、22.66、24.30和24.52min,解析的物質依次為正十四酸乙酯(較強離子峰m/z為55、69、79、99、105、109、120、133、147、161、175、189、204),反-11-正十六一烯酸乙酯(較強離子峰m/z為55、74、87、143、185、207、229、270),正十六酸乙酯(較強離子峰m/z為55、69、83、88、97、111、129、152、237、282),反-9-正十八碳一烯酸乙酯即油酸乙酯(較強離子峰m/z為55、67、81、95、109、123、150、263、294),正十八碳酸乙酯(較強離子峰m/z為55、69、89、97、111、123、180、222、260、310)。乙醇酯類物質的相對總含量為6.48%,其中正十八碳酸乙酯為總乙醇酯類的61.12%,反-9-正十八碳一烯酸乙酯為總乙醇酯類的20.28%,十八碳酸乙酯為乙醇酯類物質的81.4%。丙醇酯僅1個組分出峰位置為28.64min,在m/z為55、83、97、109、264有較強的離子碎片峰,解析為順-9-正十八酸-(2,3-羥基)-丙醇酯,占總相對含量的24.33%。己醇酯在m/z為57、70、83、98、112有強的離子碎片峰,出峰位置為12.30min,為2-乙基-1-己醇,占相對總含量的1.14%。將小眼書虱的表皮脂類組分進行EXCE軟件分析,如圖2、3示。由質譜的解析結果發現,酯類為小眼書虱表皮組分的主要物質,按照酯類化合物含的醇類結構分為甲醇酯、乙醇酯、丙醇酯及己醇酯,按照酯類化合物含的脂肪酸飽和度分為飽和脂肪酸酯、一烯酸酯、二烯酸酯,按照酯類化合物含的脂肪酸碳院子數分為乙酸酯、十四碳酸酯、十六碳酸酯,按照酯鍵數量分為單酯和三酯。醇類和脂肪酸為合成酯類的前體,即游離的脂肪醇和游離的脂肪酸,十八碳酸酯(包括游離脂肪醇:1-正十八醇和游離脂肪酸:順-6-正十八碳一烯酸)占總酯類組分的98.794%。3昆蟲體壁表皮成分鑒定體壁是昆蟲蟲體的內部器官和外界環境之間的一道天然的屏障,是昆蟲的外骨骼,好像高等動物的皮膚,覆蓋著昆蟲體軀的全部。昆蟲的體壁具有堅韌而精細的結構,既起著保護作用,同時也是營養成分的儲備場所。由于昆蟲生長發育的內在因素及外在因素的影響,按照傳統的按照形態學方法鑒定昆蟲手段較困難,尤其是對近緣種的區分,因此利用現代化學技術方法,分析昆蟲