快速高分辨液相色譜-質譜聯用技術在血漿組學研究中的應用

1血漿檢測的難點及對策代謝組學是一項研究生物內源性代謝的一般和變化規律的科學。作為系統生物學的重要組成部分，它在藥物、藥理學等領域得到了迅速發展，并在藥物篩選和其他領域得到了成功應用。人體血漿作為代謝組學研究中的重要體液樣本,其中含有2000多種內源性小分子代謝物,與常見的尿液樣本相比,前處理過程相對復雜。首先,由于含有大量的蛋白質類成分,因此進行HPLC-MS分析前需要去除蛋白質;其次,由于血漿中所含成分種類繁多、極性跨度很大,既有高極性的氨基酸、葡萄糖、核苷類等,也有低極性的脂類、固醇類等代謝物。代謝物成分的復雜性增加了血漿樣品分析的難度與挑戰。本研究采用快速高分辨液相色譜-質譜聯用技術(Rapidresolutionliquidchromatography-massspectrometry,RRLC-MS)技術,針對血漿樣品前處理中常用的有機溶劑沉淀蛋白法與固相萃取方法進行了比較,并進行了方法優化及方法學考察;采用主成分分析(Principalcomponentanalysis,PCA)對穿插在檢測序列中的質量控制(Qualitycontrol,QC)樣品數據進行統計分析,最終建立了適合于代謝組學研究的血漿樣品前處理方法。2實驗部分2.1儀器、標準品及測量體Agilent1200SeriesRRLCsystem(德國WaldbronnAglientTechnologies公司);QTRAPTM四極桿-線性離子阱串聯質譜儀(美國AppliedBiosystems/MDSSCIEX公司),配有ESI源和AnalystQS1.5數據處理系統;乙腈、甲醇、乙醇、丙酮和甲酸(色譜純,Merck公司);標準品分別購自Fluka公司、Sigma-Aldrich公司及中國藥品生物制品檢定所;實驗用水為超純水。人血漿樣品(EDTA抗凝),采自中國醫學科學院北京協和醫院,采集后立即于-80℃冷凍保存。2.2流動相和線性梯度洗脫條件ZorbaxAq-C18色譜柱(100mm×2.1mm×1.8μm;美國Agilent公司);流動相:A為H2O(含0.1%formicacid);B為CH3CN。線性梯度洗脫:0～20min,0～100%B;20～23min,100%B。每次進樣前,色譜柱在初始流動相條件下平衡8min,流速250μL/min。柱溫60℃;進樣量5μL。2.3dp氣大設ESI離子源,分別采用正、負離子EMS掃描模式,噴霧電壓為5500～4500V,解簇電壓(DP)為50～-50V,源溫度375℃,霧化氣為7.5MPa,干燥氣為6.5MPa,氣簾氣為4.0MPa,掃描范圍為65～850Da。數據采集和處理采用Analyst1.5數據處理系統。2.4標準物質和樣品的制備2.5x-ms-msx-ms由RRLC-ESI-MS檢測獲得的QC樣品最初數據經過WifftomzDatatranslatorsoftware(version1.0.0.4,AppliedBiosystems/MDSSciex)轉換成XCMS可識別的mzData格式,閾值設置為1%。采用XCMS進行保留時間校準、峰識別、濾噪、峰匹配,獲得可視化的原始二維數據陣。獲得的數據矩陣導入多變量統計軟件SIMCA-Psoftware12.0(UmetricsAB,Ume?,Sweden)進行PCA分析。3結果與討論3.1提取方法的優化本研究對血漿處理中常用的有機溶劑沉淀法(包括4種不同的溶劑系統:甲醇、乙腈、甲醇-乙醇(1∶1,V/V);甲醇-乙腈-丙酮(1∶1∶1,V/V)和固相萃取方法進行了系統分析。空白血漿中加入5μL混合標準品1,采用不同方法進行前處理,通過對各處理方法獲得的總離子流圖中色譜峰數量、峰強度及混合標準品1中各化合物峰面積的考察,獲得每種方法對各成分的提取效果,結果如圖1所示。從圖1可見,16個化合物經過沉淀蛋白處理后均可得到檢測,而經過SPE處理后有3個化合物(煙酸,肌酐和半胱氨酸)未被檢測到。此外,對不同方法處理后的色譜峰強度進行比較發現,大部分化合物在經乙腈沉淀處理后獲得的強度最高,而SPE處理后化合物的提取效果較差,這是由于SPE處理時極性大的化合物在固相萃取柱上的保留效果較差,以致流失;雖然蛋白與小分子的親和作用,使得在有機溶劑沉淀蛋白時一部分小分子化合物也會隨著蛋白一起沉淀而損失,但是與SPE中化合物的流失相比,大部分化合物,尤其是極性較大化合物的提取效果更好,因此,目前諸多研究中血漿前處理也采用乙腈沉淀法。對乙腈沉淀蛋白方法中沉淀溶劑的體積及溫度進行了優化。分別選擇血漿與乙腈的體積比為2∶1,3∶1,4∶1,5∶1的溶劑系統對沉淀體積進行比較,結果表明,3倍體積的乙腈對大部分化合物的提取效果最佳(圖2)。溶劑的溫度優化為冷溶劑(乙腈放入4℃冰箱冷藏24h)與室溫溶劑的效果比較(圖3),結果顯示,冷藏保存的乙腈有更佳的提取效果。該結果與文獻的結論一致,確證了冷溶劑進行提取方法的有效性。3.2研究方法的結果3.2.1標準品的檢測儀器的精密度考察:將配制的標準品混合溶液2分別稀釋10、50和100倍(即配制為10倍體液濃度、2倍體液濃度、體液濃度的10種標準品混合溶液)。稀釋后的混合液2分別進行RRLC-MS檢測分析,通過連續進樣6次,計算各色譜峰保留時間和提取離子色譜峰峰面積的RSD值。結果表明,在10倍體液濃度溶液中10個標準品化合物的RSD值均小于15%,8個化合物RSD值小于5%;尤其是在檢測信號強度較低(Peakarea≤107)時,RSD均小于5%;2倍體液濃度和體液濃度溶液中10個標準品化合物RSD指均小于15%;檢測信號強度較低(Peakarea≤107)時,RSD均小于10%。人體內的部分微量代謝物對維持機體正常的生理活動至關重要。本結果說明,在使用代謝組學方法找到的可能生物標志物中,即使提取離子峰強度較低的代謝物的可靠性也較高。方法的精密度考察:分別取混合標準品2溶液6,3和1.5μL,加入150μL空白血漿中,采用3倍體積乙腈沉淀法進行樣品前處理,高中低3個濃度水平分別平行測定6次;采用RRLC-MS進行檢測,并計算相應化合物的提取離子色譜峰面積RSD值。結果顯示,10個標準品化合物在3個濃度下的RSD值均小于20%,表明方法的精密度良好。3.2.2不同冷凍循環處理對同一份血漿樣品分別進行凍融1,2和3次處理(每組重復處理2次),考察凍融循環后樣品的穩定性。具體步驟如下:取6份相同血漿各150μL,分別標記為①～⑥,①②加入7.5μL混合標準溶液后按前處理方法處理;③～⑥加入7.5μL混合標準溶液后20℃冷凍保存;樣品復融,③和④加入7.5μL混合標準溶液后按2.4(2)節步驟繼續處理;⑤和⑥融化后再一次20℃冷凍,4℃融化后按2.4(2)節步驟處理。經過不同冷凍循環處理后的樣品,測定標準品中所含化合物的提取離子峰峰面積,并計算RSD值,結果均小于15%。結果表明,樣品經不同凍融循環后,不會引起數據統計學上的差異,樣品凍融穩定性良好。3.3回復突變實驗結果采用本方法對大批量血漿樣本進行代謝組學分析,連續進行5次測定QC樣本,使系統達到平衡,每分析10個血漿樣本穿插1次QC樣本的檢測。圖4是分別在正、負離子檢測模式下,17次QC樣本經RRLC-MS檢測的結果進行PCA分析后,各樣本在第一個主成分上的投影結果。結果表明,17次檢測中前5次的偏差較大,之后9次偏差控制在2SD范圍內。該結果也表明,大批量樣品分析的精密度良好,測試樣本之間的差別主要來自于樣本中代謝物的差異,而不是來自分析方法的誤差,說明代謝組學研究中發現的生物標志物的可靠性。通過方法學考察后,最終確定的血漿前處理方法流程圖如圖解1