黃瓜的化學應答與黃守瓜的劃圈取食行為

植物和昆蟲之間的相互作用關系一直是科學研究的先進之一。特別是關于植物和昆蟲三個營養環境中化學關系的澄清，結果表明，昆蟲可以喚醒和釋放植物釋放的物質。昆蟲可以通過視覺、感知和感知與植物相互作用。它是昆蟲捕獲植物最直接的響應機制。一些Acalymma,Aulacophora和Diabrotica屬甲蟲在取食它們的寄主植物時,往往是先用口器在植物葉面劃圈,然后再取食圈內的葉組織.對這些甲蟲有趣的取食行為,有2種不同的解釋:一種解釋認為[5~7],當甲蟲取食葉面時,寄主植物根部合成貯存的葫蘆素會迅速遷移到葉面以阻止甲蟲取食,甲蟲為了克服植物的這一化學防御而采用了劃圈取食的對策;另一種解釋則認為,甲蟲劃圈取食是為了避免葉面的膨壓和分泌的黏質,與植物的化學防御不相關.前一種解釋最主要的問題在于葫蘆素往往是這些甲蟲取食的引誘物質,寄主植物葉中的葫蘆素往往刺激甲蟲取食,而不是阻止或防御它們的取食,而后一種解釋目前還缺乏有力的證據支持.黃足黃守瓜(AulacophorafemoralischinensisWeise)是一種在中國廣為分布的瓜類植物害蟲,黃守瓜成蟲對一些瓜類植物就是采用先劃圈后取食圈內葉組織的方法.這一有趣的現象早已被發現,但從未有任何機理方面的研究和解釋.本文從黃守瓜的取食行為和黃瓜(CucumissativusL)的化學應答方面入手,對這一現象的機理予以探討.1葫蘆素的測定(ⅰ)受試材料和藥品.黃瓜選用華南地區主栽品種粵1號;黃守瓜為單一雌蟲卵孵化培養的第二代成蟲;葫蘆素C和Ⅰ純品通過液相色譜(HPLC)方法從葫蘆素粗品(天津醫藥公司)中分離獲得;其他有機溶劑均為市售色譜純或分析純試劑.(ⅱ)田間調查.2003年4~7月間分別在廣州和沈陽兩地選擇栽種黃瓜、南瓜(Cucurbitamoschata(Duch)Poir)、絲瓜(Luffaacutangula(L)Roxb)、苦瓜(MomordicacharantiaL)和西瓜(Citrulluslanatus(Thunb)Mansfeld)的菜地進行(各瓜類作物均為當地主栽品種).調查隨機抽樣進行,每一作物至少抽樣9次,主要觀察田間黃守瓜成蟲對各種瓜類作物葉面的取食行為和選擇性.(ⅲ)溫室實驗.在用50目濾網罩住的籠(15cm×10cm×12cm)中,放入盆栽的子葉期黃瓜幼苗1株或1片離體黃瓜鮮子葉(放在潤濕的脫脂棉上).然后每籠放入1頭停止飼喂24h的黃守瓜成蟲,觀察黃守瓜對活體或離體黃瓜子葉的取食行為.當黃守瓜取食30s后,從籠中取出生長黃瓜幼苗盆或離體鮮葉,放置實驗預設的時間間隔后采集子葉測定它們的葫蘆素含量.所有處理均設9個重復.溫室溫度在20~30℃,相對濕度為75%~90%.(ⅳ)葫蘆素定性定量分析.依據預設的時間間隔,分別采集100mg被黃守瓜取食的黃瓜活體或離體子葉,然后加1mL氯仿勻化浸提5min,浸提液離心過濾,殘渣用3×1mL氯仿洗滌后離心過濾.合并濾液用氮氣濃縮至1mL,濃縮液加入反相C18SepPak微固相萃取柱(Waters公司)中,萃取柱先后用水和50%甲醇水溶液淋洗(3×1mL).50%甲醇水溶液淋洗相吹氮氣濃縮至100μL后進行定性定量分析.黃瓜子葉浸提液首先在FinniganTSQ-7000型液相色譜/質譜(LC/MS)聯用儀上對葫蘆素進行定性測定,依據質譜分子量值及特征離子判斷葫蘆素的種類及相應的色譜峰位置(葫蘆素C:色譜保留時間,3.55min;M+-60,500;m/z,482;470;111;43.葫蘆素Ⅰ:色譜保留時間,2.75min;M+,514;m/z,146;96;43.).LC/MS測定條件如下:色譜柱為C18反相柱(Hypersil,125×4mm,5μm),色譜流動相為甲醇/水溶液(7︰3,體積比),流速為0.5mL/min,紫外檢測波長228nm,進樣量為10μL.質譜采用大氣壓化學電離(atmosphericpressurechemicalionization,APCI)方式,氮作為碰撞氣體.質譜滯留時間為500ms,持續時間10min,停頓時間5min.所有測定均在正離子質譜模式下進行,并采用多重反應監測方式(multiplereactionmonitoringmode,MRM)監測相關的離子.黃瓜子葉中葫蘆素C和Ⅰ的定量分析在HP-1100型HPLC儀上進行,測定條件與上述LC/MS中的色譜條件基本相同,但流速提高到1.5mL/min,進樣量為30μL.HPLC定量分析采用內標法,分別以準確配制的葫蘆素C和Ⅰ純品的甲醇溶液進樣,以進樣濃度為橫坐標,峰面積為縱坐標繪制出標準曲線.測試樣品中葫蘆素C和Ⅰ含量分別以它們各自的色譜峰面積為基準從標準曲線中換算.(ⅴ)生測.將黃瓜子葉1cm直徑的葉碟,分別在實驗設定濃度的葫蘆素C和I的氯仿溶液中蘸2s,另設只蘸氯仿的葉碟為對照.葉碟在氯仿揮發后放入直徑12cm的培養皿中,培養皿放置一層濾紙,下襯濕紗布.每皿分別放入2片處理和對照的葉碟(等距離間隔放置),再放入1頭停止飼喂24h的黃守瓜成蟲.培養皿放入培養箱(25±2℃,L︰D=16︰8),4h后用毫米方格紙分別統計處理和對照葉碟被取食的面積,結果以取食指數(feedingindex,FI)表征:C為對照葉碟被取食面積,T為處理葉碟被取食面積,FI>0表示刺激取食,FI<0表示拒食.所有生測均在相同的條件下重復5次.2結果2.1黃守瓜的劃圈取食行為廣州和沈陽南北兩地區的田間觀察結果表明,黃足黃守瓜成蟲主要劃圈取食黃瓜和南瓜,而不取食絲瓜、苦瓜和西瓜等其他瓜類植物,而且這種劃圈取食行為可以發生在黃瓜和南瓜幼苗子葉到成熟植株葉面的各個階段.黃守瓜成蟲飛到葉面后,以身體為半徑在30s內旋轉咬食劃圈,然后取食圈內葉組織,瓜葉一旦被劃圈取食,其他的黃守瓜在至少24h內不再取食.這些田間觀察結果通過在溫室內以黃瓜為取食植物的實驗得到進一步的驗證,而且一個重要的發現是,黃守瓜的這一劃圈取食行為僅發生在活體黃瓜葉面,對離體的黃瓜鮮葉,黃守瓜是直接取食,而不發生先劃圈后取食圈內葉組織的行為(圖1).這顯示黃守瓜的劃圈取食行為明顯地與黃瓜被取食后的響應相關.值得一提的是,黃足黑守瓜(AulacophoracattigarensisWeise)主要取食絲瓜,而且幾乎不采用劃圈取食的方法,顯示守瓜屬成蟲,即使非常接近的種不僅對取食的瓜類植物有選擇性,而且取食行為也有很大的差異.2.2葫蘆素c黃守瓜對黃瓜活體和離體鮮葉根本不同的取食行為,應歸結于活體黃瓜能對黃守瓜的取食產生響應,而離體鮮葉則不能產生相應的機制.如果這種響應機制與化學防御相關,黃瓜葉面被黃守瓜取食前后的相關化學物質應有顯著的變化.LC/MS和HPLC測定結果顯示,當黃瓜被黃守瓜劃圈取食后,子葉中葫蘆素C的含量在60min內增加10倍以上,15min后子葉中還出現可測的葫蘆素Ⅰ,并在60min內達到75μg/g鮮重的水平(圖2),而且這一黃瓜子葉中高水平的葫蘆素C和Ⅰ至少持續24h,但同樣的結果并沒有出現在圈內葉組織和離體鮮葉的實驗中.黃瓜子葉含有葫蘆素C,一般不含有其他種類的葫蘆素,而且葫蘆素C含量高的黃瓜品種更易被相關甲蟲取食,這一結果早已被闡明.雖然一些黃瓜屬的植物如Cucumisprophetarum能合成葫蘆素Ⅰ,但黃瓜子葉在被黃守瓜取食后能產生葫蘆素Ⅰ則沒有被報道.很顯然,葫蘆素Ⅰ是黃瓜對黃守瓜取食的一種重要的化學響應物質.進一步的試驗證實,黃守瓜取食前,黃瓜根和子葉中只含有葫蘆素C,而不含有可測的葫蘆素Ⅰ,葫蘆素Ⅰ只能在黃守瓜取食后的根葉中檢出,而且子葉中葫蘆素Ⅰ的含量高于根組織(圖3).這表明葫蘆素Ⅰ是黃瓜被黃守瓜取食后誘導產生的,而且很可能是葉組織直接合成,而不是從根部合成貯存后遷移到葉面的.2.3葫蘆素c和的混合物對黃守瓜攝食的抑制效應黃瓜在被黃守瓜取食后,子葉中葫蘆素C和Ⅰ含量的顯著變化表明,這2個化合物與黃守瓜的劃圈取食行為有關.生測結果顯示,葫蘆素C在10~250μg/g濃度范圍內均刺激黃守瓜取食,250μg/g以上濃度則開始顯示抑制取食效應,而葫蘆素Ⅰ則在50μg/g低濃度就開始抑制黃守瓜取食(圖4).這顯示高劑量的葫蘆素能抑制黃守瓜取食.黃守瓜取食黃瓜后,黃瓜子葉中葫蘆素C含量升高的最大值為91μg/g,難以達到抑制取食的250μg/g門檻,而黃瓜子葉中葫蘆素Ⅰ的含量在取食后60min能達到75μg/g抑制取食門檻(圖2和4).這表明,黃瓜子葉中的葫蘆素C是黃守瓜取食的刺激物質,而葫蘆素Ⅰ則是黃守瓜取食的抑制物質.但黃瓜子葉中被黃守瓜取食誘導合成的葫蘆素Ⅰ含量最大值75μg/g對黃守瓜的取食抑制效應并不顯著(圖4),這樣有理由推測,黃瓜對黃守瓜取食的抑制作用應是兩種葫蘆素的協同效應.這樣進一步以黃守瓜劃圈取食后60min時,黃瓜子葉葫蘆素C和Ⅰ的含量為濃度進行生測,結果發現葫蘆素C和Ⅰ的混合物比相同濃度的單一葫蘆素Ⅰ對黃守瓜取食的抑制效應明顯增強(圖5).3葫蘆素的食性植物的乳液防御(latexdefense)常導致一些昆蟲采用切割葉脈的取食方式,葫蘆科植物分泌的黏質及韌皮部確能增加相關甲蟲取食的困難.但黃守瓜取食黃瓜時,黃瓜子葉能迅速增加葫蘆素的種類,并達到抑制其取食的濃度,這表明黃瓜對黃守瓜的取食產生了化學響應.黃守瓜為了應對黃瓜的這一化學響應機制而采用劃圈取食的方法,這不僅阻斷了圈內黃瓜葉組織進一步合成葫蘆素,也使圈外葉組織合成的葫蘆素不能遷移到圈內,而離體鮮葉脫離了黃瓜幼苗,不再具備相應的化學應答機制,這就導致圈內葉組織和離體鮮葉中葫蘆素的種類和濃度難以發生變化,從而使得黃守瓜能取食圈內的葉組織或直接取食離體鮮葉.另外,黃瓜幼苗子葉在黃守瓜取食后增加的葫蘆素C和Ⅰ的含量,能持續相當長的時間,使黃守瓜不能取食同一瓜葉,以保證自身在短期內不被進一步侵食.黃守瓜的取食行為和黃瓜的化學響應是它們為生存而形成的一種巧妙的自我保護策略.上述結果能夠支持相關的化學防御假設[5~7],但黃瓜對黃守瓜取食的化學應答不應是其防御的全部機制,只能是主要機制之一.而黃守瓜劃圈取食行為不發生在離體黃瓜鮮葉的結果則顯示葉膨壓與黃守瓜劃圈取食行為關聯不大.葫蘆素是一類四環三萜化合物,對人及大多數動物均有毒害作用,但一些甲蟲卻突破了葫蘆科和十字花科等植物合成葫蘆素的化學防御,反而利用取食葫蘆素來防御自身的天敵.目前已分離鑒定了10余種結構不同的葫蘆素,大量的研究顯示單一的葫蘆素往往刺激一些昆蟲的